シイタケゲノム編集技術の確立と子実体保存性関連遺伝子の解析

点击翻译按钮获取中文摘要

本研究の目的は、シイタケにおいて交配可能かつ形質転換効率の高い１核菌糸を単離し、その株でCRISPR/Cas9によるゲノム編集技術を確立することと、子実体の保存性に関与する遺伝子を破壊してその機能を解析し、最終的に実用化可能な株を取得できる育種法を確立することである。昨年に引き続き、シイタケ子実体から胞子を回収して、胞子の冷蔵あるいは冷凍による保存条件に関して検討した。シイタケは、これまで形質転換に用いてきたSR-1株と市販株2株の3菌株を用い、胞子の保存温度は4℃と－80℃とした。各株の発芽率は2％から3％であり、各株の保存後の発芽率は、0℃よりは-80℃が高い傾向にあり、4℃では30日、-80℃では60日保存で1％の発芽率が保持された。CRISPR/Cas9によりゲノム編集を行うために必要な１本鎖のガイドRNA（sgRNA）に関しては、モデル遺伝子として破壊を想定しているラッカーゼ1(lcc1)遺伝子のsgRNAは昨年設計した。今年度は、遺伝子破壊株の選抜のために必要なマーカー遺伝子として、シイタケの内在性遺伝子であるsdc-ipに１塩基変異を導入して１アミノ酸を変異させたカルボキシン耐性遺伝子cbxを利用するため、sdc-ip破壊のためのsgRNAを3種類デザインし、in vitroでの切断を確認した。次に、cbxをドナーベクターとして利用して、sdc-ipをcbxに変化するためには、PAM配列が残っているとcbxも切断されてしまうことから、PAM配列を改変したドナーベクターを設計した。現在、胞子株等への薬剤耐性遺伝子発現ベクターの導入を試みている。