Study of non-invasive artificial insemination method by artificial cell membrane fusion in sperm and oocyte.

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実験動物を対象とした顕微授精は、凍結精子からの個体復元や、繁殖困難な系統の経代に用いるが、汎用されているICSIでは作製した受精卵からの胎子発生率は低い。その原因は、卵子へのピペット挿入による物理的損傷や、精子と共に注入する培地の化学的な毒性が考えられる。そのためピペット挿入を行わない、卵子と精子の細胞膜融合を人工的に促進して授精させる方法を開発する。本年度は、精子と卵子の細胞膜を高電圧で融合して授精させる研究を主軸とした。アクロソームキャップ除去の為に化学的なLysolecithin、非イオン系界面活性剤のTriton X-100、アルカリ溶液での処理および超音波で物理的に取り除く方法を検討した。その結果、Triton X-100とアルカリ溶液での除去はある程度除去が出来たが、Lysolecithinおよび超音波では不完全だったので、更なる条件検討をおこなう。卵子の膜融合の基礎的条件設定を探るために、電圧の印可を行う条件設定を検討した。透明帯を除去した卵子の表面に精子を圧着させ、2つの通電プローブの間に卵子と精子を挟み込み電圧を印加する。そして電圧、パルス、印可間隔などの設定の検討を開始した。本研究では、一度に複数の卵子を体外に取り出して長時間の顕微操作をおこなうが、時間経過と共に体外に取り出した卵子は劣化し、操作の開始と終了際の卵子の状態が異なる可能性がある。均一な実験試料の確保のため、採取した卵子を凍結保存する方法を検討した。検討の結果、凍結卵子を体外受精しても顕微受精しても、新鮮卵子と同様の受精率と発生率を得る方法ができた。この凍結卵子を適時融解して用いると共に、論文報告の準備を開始した。