Time-resolved XFEL crystallography for DNA photolyase

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ＤＮＡフォトリアーゼは、紫外線曝露により生じるＤＮＡピリミジン二量体の損傷を修復する酵素である。その反応には可視の青色光のエネルギーを必要としており、光回復酵素として知られている。この研究では、この酵素の光回復反応において、分子間反応のダイナミクスを構造化学的に明らかにすることを目的とする。我々は、古細菌Methanosarcina mazeiのクラスII-CPDフォトリアーゼ（MmCPDII）をターゲット酵素に選定した。この酵素は、高分解能のＸ線結晶構造が既に報告されており、また分光学的特徴もよく知られているのでこの研究に最適な材料である。今年度、ＸＦＥＬ実験で使用する液体ジェット噴出装置の規格に合うように、MmCPDII単体のマイクロ結晶を作成する条件を検討した。結晶化のタンパク質濃度と温度条件を最適化することにより、80μmサイズの結晶を大量に作成することに成功した。この結晶を用いて、SACLAのXFELと同じビームサイズのＸ線を作り出せるSPring-8マイクロフォーカスビームラインBL32XUにて照射実験を行い、高分解能のＸ線回折が得られることを確認した。次に、結晶中で酵素反応が進まないように嫌気的条件で結晶化させる技術を開発した。MmCPDII中に内包されるフラビン補酵素のスペクトルを計測することで、結晶中の酵素分子が還元型を保つ条件を見出した。BL32XUビームラインによる測定で、嫌気条件結晶に「グリース」を充填剤として使うことで、回折の減衰が抑えられることが確認された。この条件でMmCPDIIのマイクロ結晶を再度準備し、SACLAのBL2ビームラインにて液体ジェット装置から噴出させXFELを照射した。多数のマイクロ結晶から回折データを取得し、解析の結果、還元型結晶構造の初期モデルを構築できた。