Time-resolved XFEL crystallography for DNA photolyase

DNA 光裂合酶的时间分辨 XFEL 晶体学

• 批准号: 21K06042
• 负责人: 別所 義隆
• 金额: $ 2.75万
• 依托单位: Institute of Physical and Chemical Research
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K06042/
• 关键词: DNAフォトリアーゼ; ピリミジン二量体; 光回復酵素; XFEL; 時分割結晶構造解析

ＤＮＡフォトリアーゼは、紫外線曝露により生じるＤＮＡピリミジン二量体の損傷を修復する酵素である。その反応には可視の青色光のエネルギーを必要としており、光回復酵素として知られている。この研究では、この酵素の光回復反応において、分子間反応のダイナミクスを構造化学的に明らかにすることを目的とする。我々は、古細菌Methanosarcina mazeiのクラスII-CPDフォトリアーゼ（MmCPDII）をターゲット酵素に選定した。この酵素は、高分解能のＸ線結晶構造が既に報告されており、また分光学的特徴もよく知られているのでこの研究に最適な材料である。今年度、ＸＦＥＬ実験で使用する液体ジェット噴出装置の規格に合うように、MmCPDII単体のマイクロ結晶を作成する条件を検討した。結晶化のタンパク質濃度と温度条件を最適化することにより、80μmサイズの結晶を大量に作成することに成功した。この結晶を用いて、SACLAのXFELと同じビームサイズのＸ線を作り出せるSPring-8マイクロフォーカスビームラインBL32XUにて照射実験を行い、高分解能のＸ線回折が得られることを確認した。次に、結晶中で酵素反応が進まないように嫌気的条件で結晶化させる技術を開発した。MmCPDII中に内包されるフラビン補酵素のスペクトルを計測することで、結晶中の酵素分子が還元型を保つ条件を見出した。BL32XUビームラインによる測定で、嫌気条件結晶に「グリース」を充填剤として使うことで、回折の減衰が抑えられることが確認された。この条件でMmCPDIIのマイクロ結晶を再度準備し、SACLAのBL2ビームラインにて液体ジェット装置から噴出させXFELを照射した。多数のマイクロ結晶から回折データを取得し、解析の結果、還元型結晶構造の初期モデルを構築できた。

DNA damage caused by UV exposure In addition, it is necessary for the production of visible cyan light, and the production of light recovery enzymes. This research is aimed at the light recovery of enzymes and molecular reactions. The archaea Methanosarcina mazei was selected as a member of MmCPDII. The X-ray crystal structure of this enzyme with high decomposition energy is reported to be the most suitable material for this study. This year, XFEL has been used in the liquid jet device specifications, MmCPDII monomer crystallization conditions are discussed Crystallization mass concentration and temperature conditions were optimized and a large number of crystals were successfully produced. X-ray diffraction of SACLA and XFEL of SACLA is confirmed by X-ray diffraction of SPring-8 and X-ray diffraction of BL32 XU. In addition, in the crystallization process, the enzyme reaction was developed under the conditions of crystallization. MmCPDII contains a number of enzyme molecules, including the enzyme molecule, and the enzyme molecule in the crystal. BL32 XU Under these conditions, MmCPDII is ready for crystallization, and SACLA is ready for liquid injection. Most of the crystal structure was obtained, analyzed and constructed in the initial stage.

项目成果

Flavin photoreduction mechanism in a DNA photolyase.

DNA 光裂合酶中的黄素光还原机制。

• 发表时间: 2023
• 作者: 沼本修孝，全熙斌，鍔田武志，伊藤暢聡;Yoshitaka Bessho
• 通讯作者: Yoshitaka Bessho

XFEL analyses of molecular mechanism and structure in DNA photolyase photoreduction.

XFEL 分析 DNA 光解合酶光还原的分子机制和结构。

• 发表时间: 2021
• 作者: Quan X.;Numoto N.;Tsubata T.;Ito N.;Yoshitaka Bessho
• 通讯作者: Yoshitaka Bessho

Philipps-University Marburg(ドイツ)

马尔堡菲利普斯大学（德国）

Academia Sinica, Taiwan(その他の国・地域)

台湾中央研究院（其他国家/地区）

メタノサルキナDNA光回復酵素のXFEL時分割構造解析

甲烷沙奎纳 DNA 光激活酶的 XFEL 时间分辨结构分析

• 发表时间: 2022
• 作者: 沼本修孝，全熙斌，鍔田武志，伊藤暢聡;Yoshitaka Bessho;別所義隆
• 通讯作者: 別所義隆