Elucidation of de novo gene birth and pseudogenization processes via reconstruction of ancestral transcriptional regulation

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2021年度には、類人猿においてヒトに至る系統で生じた/失われた遺伝子のプロモーター領域を同定し、分子系統解析によりそれらの祖先配列を推定した。2022年度には、超並列レポーターアッセイを用いてプロモーター祖先配列の活性を計測した。対象とする遺伝子から400箇所のプロモーターを選び、その祖先配列をもとにして超並列レポーターアッセイのプロトコルに適合するように約18,000配列のオリゴヌクレオチドプールを設計、合成した。プールされたオリゴヌクレオチドにランダムバーコードを付加し、アッセイ用に設計したバックボーンベクターに挿入してクローニングするとともに、ベクターをシーケンシングしてバーコードとオリゴヌクレオチドの対応関係を計測した。作製したプラスミドベクターをヒトの4種類の培養細胞に導入し、DNA, RNA分子のバーコードをシーケンシングしてプロモーター祖先配列の活性を計測した。加えて、先進ゲノム支援のサポートを受けて、アクティブなプロモーターのヒストンマークであるH3K4me3をターゲットとするHiChIP解析を行った。HiChIPには上記のヒト培養細胞の他にカニクイザルの細胞も用いている。先進ゲノム支援にHiChIPのライブラリ調整とシーケンシングを依頼し、納品された配列データを解析した。その結果、対象とするプロモーターの約半数でコンタクトするゲノム領域が見つかった。これらよりエンハンサーの候補となる領域を絞りこみ、その祖先配列を推定している。