Functional characterization of Myc-depedent ribosomes by Ribo Mega-SEC coupled to mass spectrometry-based proteomics

リボソームは生物に必須の細胞内翻訳装置である。がん細胞はリボソーム合成を活性化させてリボソーム量を増やし、その成長と増殖に必要なタンパク質量を確保する。転写因子Mycはリボソームの全構成成分の遺伝子転写と、リボソーム自体の合成に必要なタンパク質群の遺伝子転写を促進することで、リボソーム量の増加に寄与する。本研究では、Mycによるリボソームの質的変化とそれに起因する翻訳能の変化も細胞がん化に関わるのではないか？という仮説のもと、Myc依存的なリボソームとの相互作用タンパク質の変化を系統的に解析することを目的としている。昨年度は最新のuHPLC装置を用いてさらなる最適化を行なうことで、従来よりも高感度・高再現的なリボソームの分離法を確立している。そこで本年度は本手法を用いて、Myc発現依存的なリボソーム構成成分の変化をより高深度で解析することを試みた。薬剤添加によりMycを発現する神経芽腫細胞株に対して薬剤処理・未処理を行ない、細胞を可溶化後にRibo Mega-SECにより分離することで翻訳が活発なポリソーム画分を得た。その画分に含まれるタンパク質を精製後、トリプシンによる消化によりペプチドを生成し、LC-MS/MS解析を行なった。その結果、2800以上のタンパク質の同定と定量に成功し、Myc発現依存的に変動するリボソーム相互作用因子群を特定した。

リボソームは生物に必須の細胞内翻訳装置である。がん細胞はリボソーム合成を活性化させてリボソーム量を増やし、その成長と増殖に必要なタンパク質量を確保する。転写因子Mycはリボソームの全構成成分の遺伝子転写と、リボソーム自体の合成に必要なタンパク質群の遺伝子転写を促進することで、リボソーム量の増加に寄与する。本研究では、Mycによるリボソームの質的変化とそれに起因する翻訳能の変化も細胞がん化に関わるのではないか？という仮説のもと、Myc依存的なリボソームとの相互作用タンパク質の変化を系統的に解析することを目的としている。昨年度は最新のuHPLC装置を用いてさらなる最適化を行なうことで、従来よりも高感度・高再現的なリボソームの分離法を確立している。そこで本年度は本手法を用いて、Myc発現依存的なリボソーム構成成分の変化をより高深度で解析することを試みた。薬剤添加によりMycを発現する神経芽腫細胞株に対して薬剤処理・未処理を行ない、細胞を可溶化後にRibo Mega-SECにより分離することで翻訳が活発なポリソーム画分を得た。その画分に含まれるタンパク質を精製後、トリプシンによる消化によりペプチドを生成し、LC-MS/MS解析を行なった。その結果、2800以上のタンパク質の同定と定量に成功し、Myc発現依存的に変動するリボソーム相互作用因子群を特定した。