权益分类	功能权益	普通用户	{{item.name}}会员
{{category.name}}	{{benefitItem.name}}

難培養真菌のミニメタゲノム解析法の確立と新規遺伝子の探索

难培养真菌微型宏基因组分析方法的建立及新基因的寻找

基本信息

批准号：
21K06141
负责人：
梅山大地
金额：
$ 2.75万
依托单位：
Institute of Physical and Chemical Research
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

昨年度まで真菌の細胞表面に存在するグルカンなどに特異的に結合するプローブを作製してきたが、今年度はそれらの結合能の向上を目指して実験を行った。結合ドメインと蛍光蛋白質を連結するリンカー長の最適化とドメインの多重化を行い、出芽酵母や分裂酵母をモデルに用いて結合能を評価した。ドメインをダイマー化したところ、全てのプローブで結合能の上昇がみられ、トリマー化したところ一部のプローブでわずかに結合能が増大した。しかし、ドメインの連結数を増やすにつれて発現量が低下し、テトラマー化、ペンタマー化しても結合能の上昇は見られなかった。そのため、プローブはダイマーあるいはトリマーとして用いることとした。また、N末端に分子シャペロンを融合したところ、結合能や発現量が上昇したプローブもあったため、それらはシャペロン融合たんぱく質として用いることとした。これらのプローブの発現量の上昇を目的として、開始コドン下流と終止コドン上流にTranslation Enhancer Elementを挿入したところ、全てのプローブで発現量の増大がみられた。また、ヒト糞便50 mgに対するプローブや磁性ビーズの投入量の最適化も行った。前年度までに見出した細菌特異的な溶菌酵素群の反応最適化を行った。文献検索を行ったところ、Zn2＋を補因子とする酵素も含まれていたため、反応系に添加するZnCl2濃度の最適化を行った。ヒト便に含まれる細菌量を16S rDNAのqPCRで定量したところ、ZnCl2を加えることで４倍程度活性が増大する条件を見出した。また、分子シャペロンの融合や反応時間および緩衝液の組成などの検討を行うことで細菌特異的な溶菌反応の最適化を行った。前年度までに最適化した密度勾配遠心の条件と今年度最適化したプローブとの結合条件や細菌特異的な溶菌反応条件を組み合わせて、実サンプルからの真菌の濃縮を開始した。

In the past year, fungi have been found on the surface of cells, and specific binding activities have been carried out. In the present year, binding activities have been directed upwards. The binding energy of the protein chain is evaluated by optimizing the length of the protein chain, multiplexing the protein chain, budding yeast and splitting yeast. The binding energy of a part of a plant increases. The number of links in the network is increasing, and the number of links in the network is decreasing.そのため、プローブはダイマーあるいはトリマーとして用いることとした。The N-terminal molecules are raised. The increase in the amount of Translation from the beginning to the end of the translation Element increases the amount of translation from the beginning to the end. 50 mg/kg/day In the past year, we have seen the optimization of bacteria-specific lysozyme groups. Literature search for the optimization of ZnCl2 concentration by adding Zn2 + to the enzyme system The quantity of bacteria contained in the sample was quantified by qPCR and the activity of ZnCl2 was increased by 4 times. The fusion and reaction time of the molecule and the composition of the buffer solution were discussed and the bacteria-specific lysis reaction was optimized. In the past year, the optimization of density matching remote conditions and this year's optimization of the combination of conditions and bacteria-specific lysis conditions were carried out.