難培養真菌のミニメタゲノム解析法の確立と新規遺伝子の探索

难培养真菌微型宏基因组分析方法的建立及新基因的寻找

• 批准号: 21K06141
• 负责人: 梅山 大地
• 金额: $ 2.75万
• 依托单位: Institute of Physical and Chemical Research
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K06141/
• 关键词: 真菌の分離; メタゲノム解析; 蛍光ラベル; 磁気分離; 溶菌酵素; 真菌叢の分離; マイクロバイオーム; 真菌叢; 細胞分離; ミニメタゲノム; 遺伝子機能解析

昨年度まで真菌の細胞表面に存在するグルカンなどに特異的に結合するプローブを作製してきたが、今年度はそれらの結合能の向上を目指して実験を行った。結合ドメインと蛍光蛋白質を連結するリンカー長の最適化とドメインの多重化を行い、出芽酵母や分裂酵母をモデルに用いて結合能を評価した。ドメインをダイマー化したところ、全てのプローブで結合能の上昇がみられ、トリマー化したところ一部のプローブでわずかに結合能が増大した。しかし、ドメインの連結数を増やすにつれて発現量が低下し、テトラマー化、ペンタマー化しても結合能の上昇は見られなかった。そのため、プローブはダイマーあるいはトリマーとして用いることとした。また、N末端に分子シャペロンを融合したところ、結合能や発現量が上昇したプローブもあったため、それらはシャペロン融合たんぱく質として用いることとした。これらのプローブの発現量の上昇を目的として、開始コドン下流と終止コドン上流にTranslation Enhancer Elementを挿入したところ、全てのプローブで発現量の増大がみられた。また、ヒト糞便50 mgに対するプローブや磁性ビーズの投入量の最適化も行った。前年度までに見出した細菌特異的な溶菌酵素群の反応最適化を行った。文献検索を行ったところ、Zn2＋を補因子とする酵素も含まれていたため、反応系に添加するZnCl2濃度の最適化を行った。ヒト便に含まれる細菌量を16S rDNAのqPCRで定量したところ、ZnCl2を加えることで４倍程度活性が増大する条件を見出した。また、分子シャペロンの融合や反応時間および緩衝液の組成などの検討を行うことで細菌特異的な溶菌反応の最適化を行った。前年度までに最適化した密度勾配遠心の条件と今年度最適化したプローブとの結合条件や細菌特異的な溶菌反応条件を組み合わせて、実サンプルからの真菌の濃縮を開始した。

直到去年，我们一直在进行探针，该探针专门与真菌细胞表面上存在的葡萄糖和其他物质结合，但是今年我们进行了实验，目的是提高其结合能力。连接结合结构域和荧光蛋白的接头长度进行了优化，并将结构域多路复用，并使用芽酵母和裂变酵母作为模型评估结合能力。当域二聚时，所有探针均显示出结合能力的增加，而修剪后的一些探针略有增加结合能力。但是，随着域链接的数量的增加，表达水平下降，即使在四聚体和五聚体后，也没有观察到结合能力的增加。因此，将探针用作二聚体或三聚体。此外，当将分子伴侣融合到N末端时，一些探针的结合能力和表达水平增加，因此将其用作伴侣融合蛋白。为了提高这些探针的表达水平，当将翻译增强子元件插入起始密码子的下游和终止密码子上游时，在所有探针中都观察到表达水平的提高。我们还优化了50 mg人粪的探针和磁珠输入的量。我们对前一年的细菌特异性裂解酶组进行了反应优化。文献搜索表明，还包括包含Zn2+作为辅助因子的酶，因此优化了添加到反应系统中的ZnCl2浓度。当通过16S rDNA量化人粪中包含的细菌量时，发现ZnCl2的活性增加了大约四倍。此外，通过检查分子伴侣融合，反应时间和缓冲液组成来优化细菌特异性裂解反应。从实际样品中的真菌的浓度是通过将优化上一年的密度梯度离心条件与针对今年优化的探针的结合条件结合在一起的条件以及细菌特异性裂解反应的条件。