難培養真菌のミニメタゲノム解析法の確立と新規遺伝子の探索
难培养真菌微型宏基因组分析方法的建立及新基因的寻找
基本信息
- 批准号:21K06141
- 负责人:
- 金额:$ 2.75万
- 依托单位:
- 依托单位国家:日本
- 项目类别:Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
- 财政年份:2021
- 资助国家:日本
- 起止时间:2021-04-01 至 2024-03-31
- 项目状态:已结题
- 来源:
- 关键词:
项目摘要
昨年度まで真菌の細胞表面に存在するグルカンなどに特異的に結合するプローブを作製してきたが、今年度はそれらの結合能の向上を目指して実験を行った。結合ドメインと蛍光蛋白質を連結するリンカー長の最適化とドメインの多重化を行い、出芽酵母や分裂酵母をモデルに用いて結合能を評価した。ドメインをダイマー化したところ、全てのプローブで結合能の上昇がみられ、トリマー化したところ一部のプローブでわずかに結合能が増大した。しかし、ドメインの連結数を増やすにつれて発現量が低下し、テトラマー化、ペンタマー化しても結合能の上昇は見られなかった。そのため、プローブはダイマーあるいはトリマーとして用いることとした。また、N末端に分子シャペロンを融合したところ、結合能や発現量が上昇したプローブもあったため、それらはシャペロン融合たんぱく質として用いることとした。これらのプローブの発現量の上昇を目的として、開始コドン下流と終止コドン上流にTranslation Enhancer Elementを挿入したところ、全てのプローブで発現量の増大がみられた。また、ヒト糞便50 mgに対するプローブや磁性ビーズの投入量の最適化も行った。前年度までに見出した細菌特異的な溶菌酵素群の反応最適化を行った。文献検索を行ったところ、Zn2+を補因子とする酵素も含まれていたため、反応系に添加するZnCl2濃度の最適化を行った。ヒト便に含まれる細菌量を16S rDNAのqPCRで定量したところ、ZnCl2を加えることで4倍程度活性が増大する条件を見出した。また、分子シャペロンの融合や反応時間および緩衝液の組成などの検討を行うことで細菌特異的な溶菌反応の最適化を行った。前年度までに最適化した密度勾配遠心の条件と今年度最適化したプローブとの結合条件や細菌特異的な溶菌反応条件を組み合わせて、実サンプルからの真菌の濃縮を開始した。
Yesterday's annual ま で fungi の に on the cell surface す る グ ル カ ン な ど に specific に combining す る プ ロ ー ブ を cropping し て き た が, our は そ れ ら の binding energy の upward を refers し て be 験 を line っ た. Combining ド メ イ ン と link protein を 蛍 light す る リ ン カ ー long の optimization と ド メ イ ン の multiple line を い and budding yeast や split yeast を モ デ ル に with い て binding energy を review 価 し た. ド メ イ ン を ダ イ マ ー change し た と こ ろ, whole て の プ ロ ー ブ で binding energy rising の が み ら れ, ト リ マ ー change し た と こ ろ a の プ ロ ー ブ で わ ず か に binding energy が raised large し た. し か し, ド メ イ ン の connectivity を raised や す に つ れ て 発 now low が し, テ ト ラ マ ー, ペ ン タ マ ー change し て も binding energy rise の は see ら れ な か っ た. そ の た め, プ ロ ー ブ は ダ イ マ ー あ る い は ト リ マ ー と し て in い る こ と と し た. Molecular シ ま た, N terminal に ャ ペ ロ ン を fusion し た と こ ろ, binding energy や 発 now rising volume が し た プ ロ ー ブ も あ っ た た め, そ れ ら は シ ャ ペ ロ ン fusion た ん ぱ く qualitative と し て in い る こ と と し た. こ れ ら の プ ロ ー ブ の 発 now rising volume の を purpose と し て, start コ ド ン obscene と termination コ ド ン upper に Translation Enhancer Element を scions into し た と こ ろ, whole て の プ ロ ー ブ で 発 quantities is の raised が み ら れ た. Youdaoplaceholder0 and ヒト 50 mg of feces に for the optimal input of するプロ ブや ブや ブや magnetic ビ ズ ズ <s:1> った った った った った った った った った った った <s:1> ズ ズ ズ <s:1> った った った った performance った. In the previous year, までに observed the specific な lysozyme group of た bacteria, <s:1> reverse 応 optimization を lines った. Literature 検 cable line を っ た と こ ろ, Zn2 + を fill factor と す も contain ま る enzyme れ て い た た め, anti 応 に add す る line optimal concentration of ZnCl2 の を っ た. Contains ヒ ト then に ま れ る bacteria amount を 16 s rDNA の qPCR で quantitative し た と こ ろ, ZnCl2 を plus え る こ と で 4 times the degree of active が raised す を る conditions show the し た. ま た, molecular シ ャ ペ ロ ン の fusion や 応 time お よ composition の び buffer な ど の 検 line for を う こ と specific な で bacteria lysis the 応 の line optimization を っ た. Before annual ま で に optimization し た density hook with telecentric の conditions と our optimization し た プ ロ ー ブ と の combining specific conditions や bacteria な lysis the を group み 応 condition わ せ て, be サ ン プ ル か ら の fungi の enrichment を began し た.
项目成果
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梅山 大地其他文献
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