一回膜貫通型蛋白質プレキシンによるシグナル伝達機構の構造学的解明

单跨膜蛋白丛蛋白信号转导机制的结构阐明

• 批准号: 21K06166
• 负责人: 鈴木 博視
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: Tokyo Medical and Dental University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K06166/
• 关键词: シグナル伝達; 一回膜貫通型蛋白質; GTPase; クライオ電子顕微鏡; 単粒子解析; 一回膜貫通タンパク質

非常に柔軟性の高い全体構造をとるヒトセマフォリン・プレキシン複合体について、一回膜貫通タンパク質クライオ電子顕微鏡に適した試料作製法の検討を継続して続けた。主に、複数種のサブタイプについて追加のクローニングを行うとともに、発現量の向上が見られる発現細胞種（特に糖鎖付加のパターンが異なるHEK293の変異株など）、発現手法（一過性およびバキュロウイルス系）を検討した。そのうち、Expi293細胞株を使用することで多くのケースにおいて発現量の増加が見られた。発現量が少ないものについては低収量ながら純度を高められるようタグの検討も行った。これらの検討は主にゲル濾過クロマトグラフィーのチャートの高さや単分散性を指標にした。ショウジョウバエ由来遺伝子のサブタイプについて、プレキシンとセマフォリンの組み合わせによって親和性が大きく異なることが分かったため、特に親和性の高い組み合わせのサブタイプについて発現・精製の最適化をおこなった。クライオ電子顕微鏡の試料作製に関しては、脂質ナノディスク再構成系では必要なタンパク質濃度を抑えられる利点があったが、粒子の配向性に偏りが生じがちで三次元再構成が困難という問題が残るため、再構成条件やグリッド作製条件の検討を継続している。界面活性剤によるミセル中では、プレキシン二量体の安定性に問題が残るとともに、電顕グリッド中での粒子数が激減し分散が悪くなる傾向があるため、できるだけタンパク質試料が高濃度になる精製条件を、発現最適化とともに継続している。また、リポソームのような脂質環境に多数のプレキシン複合体が埋め込まれた試料作製条件も検討した。

A study on the preparation method of high flexibility, high flexibility, The main and multiple species of cells are added to the cell line, and the upward appearance of the cell species is discussed.(The special sugar lock is added to the cell line, and the HEK293 cell line is different.) The use of the Expi293 cell line increased the amount of protein produced. The amount of light is low, the purity is high, and the amount of light is low. The main purpose of this paper is to improve the quality of the products. It is the origin of the child's service, the content, the content of the child's service, the content, the content of the child's service For the sample preparation of electron micromirrors, the lipid composition is necessary for the reconstruction system, the mass concentration is suppressed, and the alignment of particles is biased. The stability of two kinds of particles in the interfacial active agent is improved by increasing the number of particles in the interfacial active agent and dispersing the particles in the interfacial active agent. The preparation conditions of most of the compounds in the lipid environment were investigated.