抗がん剤耐性克服へ向けた核内受容体の活性制御機構の解明

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令和４年度はCARと補助活性化因子および補助抑制因子との結合を直接的に観測する手法の構築を試みた。最初に、蛍光タンパク質を用いた相互作用検出系の構築を試みたが、CARと補助活性化因子および補助抑制因子との相互作用は解離定数が数uM程度の弱い相互作用であり、検出感度の点で不十分であった。そこで、NanoLucを用いた相互作用検出系の構築を試みた。NanoLucは深海性のエビ由来のLuciferaseを改変したものであり、一般に使用されるホタルルシフェラーゼに比べて分子量が小さい、熱安定性が高い、発光にATPを必要としない、活性が高く発光量が多いため高感度で検出可能であるという特徴がある。このNanoLucを２つの断片 (SmBitおよびLgBit) に分割したものがSplit NanoLucである。SmBit-LgBit間の相互作用は弱く、これらの断片を混合しただけではLuciferase活性を示さない。しかし、相互作用し合うタンパク質に融合させることで２つの断片が会合し、ルシフェラーゼ活性を示す。このことを利用することで、目的タンパク質同士の相互作用を化学発光により高感度に検出可能となる。CAR-SmBit融合タンパク質、Lg-Bitと補助活性化因子もしくは補助抑制因子との融合タンパク質を作製し、相互作用解析を試みた。その結果、CARと補助活性化因子もしくは補助抑制因子との相互作用を高感度で検出することに成功した。現在、このシステムを用いて薬物フリー状態、補助活性化因子結合状態、補助抑制因子結合状態のCARと補助活性化因子もしくは補助抑制因子との相互作用解析を進めている。