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新規抗結核薬の創薬ターゲットの機能解明および検出キット作製への応用

抗结核新药药物发现靶点的功能阐明及其在检测试剂盒生产中的应用

基本信息

批准号：
21K06555
负责人：
山下沢
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Mukogawa Women's University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究では海洋海綿より抽出されたAgelasine D（Age-D）およびHalicyclamine A（Hali-A）の抗結核作用に着目し、これら化合物のターゲット分子としてそれぞれ同定されたBCG3185cとBCG2664について、相互作用解析を中心とした原子レベルでの機能解析を行うことで、創薬研究を指向した作用機序に関する研究基盤を構築する。本年度は、BCG3185cについてこれまでで最高分解能（1.8 angstrom）での結晶構造解析に成功した。さらにAge-Dとの複合体構造解析を再度トライしたが複合体構造を得ることは困難であったものの、高分解能のBCG3185c結晶構造を得たことで、この構造を基盤としたAge-Dとのドッキングシミュレーションから結合様式を議論できることが判明した。BCG2664について、昨年度までにリコンビナントタンパク質の発現を確認し界面活性剤による可溶化条件も決定し、構造解析が可能なサンプルの調製を試みているが十分な収量を確保できていない。そこでAlphaFold2による構造予測を行ったところ、BCG2664は４回膜貫通型であると考えられていたが、さらにC末端にも膜貫通していると予想される長いヘリックスが存在することが予測された。そこでそのC末端ヘリックスを欠損した変異体（2664-delC）を設計し、BCG2664-delCを大腸菌および昆虫細胞に組み込むための準備を実施した。さらに４回膜貫通型の膜タンパク質の構造解析法として、N末端とC末端にスプリットしたGFPを融合し、細胞内でスプリットしたGFPが再構成されることで４回膜貫通型の膜タンパク質を安定化させ構造解析に成功している例が複数報告されおり、この手法をBCG2664に適用した実験にも着手しはじめた。

In this study, we investigated the anti-tuberculosis effect of marine sponge extract Agelasine D (Age-D) and Halicycline A (Hali-A). The molecular structure of these compounds was determined by BCG 3185c and BCG2664. The interaction analysis was performed by atomic analysis. The mechanism of action was studied by the establishment of a research base. This year, BCG 3185c was successfully analyzed for the highest decomposition energy (1.8 angstrom). The analysis of the complex structure of Age-D is difficult to obtain, and the crystal structure of BCG 3185c with high decomposition energy is difficult to obtain. BCG2664 has been used for the determination of solubilization conditions, structural analysis, possible modulation, and determination of dissolution conditions. The structure of AlphaFold2 is predicted to exist. BCG2664 is predicted to exist. The C-terminal of BCG2664-delC was designed and prepared for E. coli and insect cell assembly. The structural analysis method of the membrane structure of the 4-loop membrane penetrating type was successfully reported. The method was applied to BCG2664.