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Evaluation method of skin sensitization using chromophore-based solid phase peptide reaction assay in vitro.

基于发色团的固相肽反应体外皮肤致敏评价方法。

基本信息

批准号：
21K06673
负责人：
有海秀人
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Tokyo University of Science, Yamaguchi
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K06673/
关键词：
皮膚感作性試験 DPRA法

项目摘要

本研究の目的は、親水・疎水両溶媒になじむレジン樹脂に固定化したペプチドを用いることで、難水溶性物質の皮膚感作性試験を可能とし、被険物質と結合していない高純度ペプチド（リジン、システイン）に対して、リジン残基に対してピクリン酸の指示薬を、システイン残基に対してエルマン試薬の指示薬を組み合わせることで、分光法で検出が可能な極めて簡便な試験法の開発である。現行の皮膚感作性試験の１つにDPRA法が用いられているが、ペプチド（リジン、システイン）と被験物質の結合をHPLCで確認する。その皮膚感作の可否は、HPLCを用いて長い時間を要する。R4年度の研究実績では、皮膚感作性を示すシンナムアルデヒド、pベンゾキノン、フルオレッセインイソチオシアネートで高純度ペプチド（リジン、システイン）と高い結合性を示すことが示された。一方、陰性対照物質であるイソプロパノール、エタノールでは高純度ペプチド（リジン、システイン）との結合は示さなかった。さらに、現行のDPRA法では、HPLCの操作と長い反応時間を要するが、本研究ではペプチド（リジン、システイン）と被験物質の反応時間を2、4、16、24時間と条件を検討した。その結果、少なくとも4時間の反応が迅速かつ十分な最適な時間であることが明らかになった。また、レジン樹脂に固定化したペプチドの設計も実施している。当初はTentagel resinにペプチドを固定していたが、使用の前にはペプチドを膨潤し、保存する際には乾燥をさせる必要があるなど、レジン樹脂に固定化したペプチドの取り扱いに難儀するといった問題があった。そこで、R4年度よりPEGA resin (Amino PEGA resin)を常に膨潤された状態で使用できることや溶媒と均一に膨潤しやすいためペプチドが感作性物質と反応しやすいことを考慮し、データのばらつきが各段に改善した。

The purpose of this study is to immobilize the insoluble substances in hydrophilic and aqueous solvents, and to test the skin sensitivity of insoluble substances. The indicator of acid for the corresponding residue of the protein is composed of the indicator of acid for the corresponding residue of the protein, and the indicator of acid for the corresponding residue is composed of the indicator of acid for the corresponding residue of the protein. The present skin sensitivity test is used to confirm the binding of the substance by HPLC. Whether the skin is sensitive or not, HPLC can be used for a long time. The results of the study in R4 showed that the skin sensitivity was high in purity and high in binding. A party, negative contrast substances, such as high-purity, high-purity, high In this study, we discussed the operation and reaction time of DPRA and HPLC, and discussed the reaction time of DPRA and HPLC. The result is less than 4 hours, and the time is faster than the time. The design of the immobilized resin was carried out. When the Tentagel resin is fixed, it is necessary to expand it before use and dry it. PEGA resin (Amino-PEGA resin) is usually used in the state of swelling, and the solvent is used to uniformly swell the sensitive substance.