Evaluation method of skin sensitization using chromophore-based solid phase peptide reaction assay in vitro.

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本研究の目的は、親水・疎水両溶媒になじむレジン樹脂に固定化したペプチドを用いることで、難水溶性物質の皮膚感作性試験を可能とし、被険物質と結合していない高純度ペプチド（リジン、システイン）に対して、リジン残基に対してピクリン酸の指示薬を、システイン残基に対してエルマン試薬の指示薬を組み合わせることで、分光法で検出が可能な極めて簡便な試験法の開発である。現行の皮膚感作性試験の１つにDPRA法が用いられているが、ペプチド（リジン、システイン）と被験物質の結合をHPLCで確認する。その皮膚感作の可否は、HPLCを用いて長い時間を要する。R4年度の研究実績では、皮膚感作性を示すシンナムアルデヒド、pベンゾキノン、フルオレッセインイソチオシアネートで高純度ペプチド（リジン、システイン）と高い結合性を示すことが示された。一方、陰性対照物質であるイソプロパノール、エタノールでは高純度ペプチド（リジン、システイン）との結合は示さなかった。さらに、現行のDPRA法では、HPLCの操作と長い反応時間を要するが、本研究ではペプチド（リジン、システイン）と被験物質の反応時間を2、4、16、24時間と条件を検討した。その結果、少なくとも4時間の反応が迅速かつ十分な最適な時間であることが明らかになった。また、レジン樹脂に固定化したペプチドの設計も実施している。当初はTentagel resinにペプチドを固定していたが、使用の前にはペプチドを膨潤し、保存する際には乾燥をさせる必要があるなど、レジン樹脂に固定化したペプチドの取り扱いに難儀するといった問題があった。そこで、R4年度よりPEGA resin (Amino PEGA resin)を常に膨潤された状態で使用できることや溶媒と均一に膨潤しやすいためペプチドが感作性物質と反応しやすいことを考慮し、データのばらつきが各段に改善した。