脊髄小脳変性症でのPKCリン酸化を介した神経保護機構の解明と新規治療法への応用

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脊髄小脳変性症(SCA)患者の小脳プルキンエ細胞ではProtein kinase C (PKC)リン酸化亢進が共通して起こり、小脳プルキンエ細胞保護的に働くことが報告されている。本研究の目的はSCAでリン酸化が亢進するPKCリン酸化基質やそのシグナル経路を同定し、そのPKCリン酸化経路を同定し、それをターゲットにした数多くのSCAに共通して適用できる新規治療法を開発することである。本年度は、前年度に同定したVCP, PLEKHG4のリン酸化欠損・模倣変異体を用いた機能解析を行った。１．VCP, PLEKHG4のリン酸化欠損・模倣変異体を整備した。２．VCPについては、siRNAでノックダウンを行い、cleaved.caspase 7, cleaved. PARPなどのアポトーシスが増加することを同定した。また、ミトコンドリア機能障害のマーカーであるGDF15の増加も確認した。また、siRNAでノックダウンしたVCPをレスキューする実験を行い、これらのアポトーシス、ミトコンドリア機能障害ともに改善することを確認した。３．PLEKHG4については、RAC1, CDC42のGEFとして働くので、これらの相互作用をリン酸化変異体を用いたRAC1, CDC42とのpull down アッセイを行った。結果的にはリン酸化欠損変異体ではRAC1, CDC42との相互作用が低下する傾向を認めた。マウスの小脳を用いた解析については、脱リン酸化酵素阻害剤の選定を行い、サンプルの脱リン酸化を防ぐ方法について検討を行い、現状よりも確実な方法を選定した。また、リン酸化プロテオームの解析方法についても、新たな試薬、手法を見出した。