イノシン三リン酸分解酵素欠損の分子病態解明

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2022年度はITPA欠損マウスNeuro2a培養細胞を用い、オートファゴソーム、小胞体、ゴルジ体、の染色パターンをコントロール細胞と比較した。また同細胞の全抽出液を用いた二次元電気泳動後のゲル銀染色パターンをコントロール細胞と比較した。いずれも差を認めなかった。ITPA欠損マウスNeuro2a細胞にヒトITPA発現ベクターもしくはコントロールベクターを導入したクローンを各々３クローン以上樹立した。これらの細胞を用いて膜電位評価を行ったところ、ITPA欠損マウス脳スライス神経細胞で観察された結果と同様の静止膜電位脱分極が観察された。このため今後はこれらの細胞を用いてITPA欠損が引き起こす影響を解析することとした。その比較をRNAseqで行うため、これらの細胞よりtotal RNAを調製した。コントロール細胞と比較してITPA欠損マウスNeuro2a細胞特異的に細胞増殖抑制と細胞死誘導がかかる培養条件を検討し見出した。この培養条件を用いて、イノシン三リン酸産生経路を明らかにするためマウス遺伝子に対するshRNAのレンチウイルスベクターライブラリー感染実験を行い、細胞増殖抑制／細胞死をレスキューするshRNAのスクリーニングを開始した。最終的に残存細胞ゲノムDNAを解析して目的shRNAの標的遺伝子を確認する。哺乳動物におけるイノシン三リン酸蓄積防止におけるNUDT16の寄与を確認するために、以前に作成したNudt16 欠損マウス(Nudt16 KO)と脳神経系特異的ITPA欠損マウスItpa-flox/Nes-Creマウスとの交配を開始し、Itpa-flox(F/+)/Nes-Cre(Tg)/Nudt16(-/-)マウスを得た。最終的にはItpa-flox(F/F)/Nes-Cre(Tg)/Nudt16(-/-)を作成、解析予定である。