ミトコンドリアtRNA修飾核酸の網羅的測定による新規ミトコンドリア病診断法の確立

本研究は、(1) ミトコンドリアからのtRNAsの効率的な抽出、(2) ミトコンドリア病患者から樹立したヘテロプラスミーの異なるiPS細胞クローンからの心筋誘導、(3) ミトコンドリアtRNA中の修飾核酸のLC-MS/MSによる一斉定量、の3項目を柱としている。ミトコンドリアtRNAsの抽出に関しては、CCA特異的ライゲーションと、プルダウンを融合した申請者独自の手法で、効率よくtRNAsのみを濃縮することが可能になった。ミトコンドリア分画の調整においても、市販のキットよりゲノムtRNAsのコンタミネーションを少なくし、ミトコンドリアtRNAのみを高効率に抽出する最適な条件を設定した。iPS細胞クローンからの心筋誘導に関しては、現在同一患者由来のiPS細胞で、異常ミトコンドリアの割合が0%と約80%のクローンを用い、いずれもトロポニン陽性率を指標として80%程度の心筋誘導効率が得られている。LC-MS/MSの測定系では、τm5s2U, ms2i6A, τm5U, f5Cといったミトコンドリア特異的な修飾核酸も測定可能となったが、現時点では、感度の問題から検出には大量の細胞を必要とすることが課題となっている。LC-MS/MSの感度を飛躍的に改善させることは困難なため、心筋への誘導より細胞数を確保しやすい血管平滑筋への誘導を行い、パイロット試験としてミトコンドリアtRNAの修飾核酸のプロファイリングを行なってみることを計画している。また、並行して行なっている研究において、ストレスにて切断されたtRNA断片が、小胞体ストレス応答などにおいて機能するRNAリガーゼ（RTCB複合体）により修復されること、さらに酸化ストレス下ではRTCBの抑制により修復が抑制されtRNA断片の産生量が増幅することを明らかにし、報告を行った。

本研究は、(1) ミトコンドリアからのtRNAsの効率的な抽出、(2) ミトコンドリア病患者から樹立したヘテロプラスミーの異なるiPS細胞クローンからの心筋誘導、(3) ミトコンドリアtRNA中の修飾核酸のLC-MS/MSによる一斉定量、の3項目を柱としている。ミトコンドリアtRNAsの抽出に関しては、CCA特異的ライゲーションと、プルダウンを融合した申請者独自の手法で、効率よくtRNAsのみを濃縮することが可能になった。ミトコンドリア分画の調整においても、市販のキットよりゲノムtRNAsのコンタミネーションを少なくし、ミトコンドリアtRNAのみを高効率に抽出する最適な条件を設定した。iPS細胞クローンからの心筋誘導に関しては、現在同一患者由来のiPS細胞で、異常ミトコンドリアの割合が0%と約80%のクローンを用い、いずれもトロポニン陽性率を指標として80%程度の心筋誘導効率が得られている。LC-MS/MSの測定系では、τm5s2U, ms2i6A, τm5U, f5Cといったミトコンドリア特異的な修飾核酸も測定可能となったが、現時点では、感度の問題から検出には大量の細胞を必要とすることが課題となっている。LC-MS/MSの感度を飛躍的に改善させることは困難なため、心筋への誘導より細胞数を確保しやすい血管平滑筋への誘導を行い、パイロット試験としてミトコンドリアtRNAの修飾核酸のプロファイリングを行なってみることを計画している。また、並行して行なっている研究において、ストレスにて切断されたtRNA断片が、小胞体ストレス応答などにおいて機能するRNAリガーゼ（RTCB複合体）により修復されること、さらに酸化ストレス下ではRTCBの抑制により修復が抑制されtRNA断片の産生量が増幅することを明らかにし、報告を行った。