Analysis of Cell-cell interaction models with CRISPR library

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腫瘍微小環境において、がん幹細胞と間質支持細胞の相互作用により薬剤耐性が誘導されることが知られている。我々は新たな実験系である「間接的CRISPR screening」を確立した。昨年までに、間接的CRISPR screeningにて得られた各候補遺伝子の変異支持細胞を作成し、それらと共培養した白血病細胞株や膵癌細胞株において抗癌剤曝露下で有意に生存・増殖することが確認された。C9orf89、MAGI2、MLPH、RHBDD2の4種 のHEK293T 欠損細胞クローンに関して、RNA-sequencingを行った。GSEA解析では、いずれの欠損細胞においてもサイトカイン活性が最も活性化されており、その中でも特にCXCL12の発現が共通して最も上昇していた。定量的PCRおよびELISAの結果よりRHBDD2欠損でのCXCL12発現・分泌上昇が確認された。また、CXCL12中和抗体を用いた共培養・Ara-C曝露実験を行ったところ、HEK293T/UE7T-9 RHBDD2欠損細胞株によるAra-C曝露下でのU937のアポトーシスの抑制が、中和抗体によりキャンセルされた。間質細胞の分泌するCXCL12による腫瘍細胞の薬剤耐性獲得機構として、PI3K-Akt-mTOR経路の活性化が知られている。HEK293T/UE7T-9 RHBDD2欠損細胞とU937を共培養し、Aktのリン酸化を評価した。U937におけるAktのリン酸化は、コントロール共培養群あるいはU937単独培養群と比較して、HEK293T RHBDD2欠損細胞と共培養した際に有意に亢進していた。また、膵癌臨床検体の検討では、間質細胞でのRHBDD2低発現が独立予後不良因子であり、またRHBDD2とCXCX12発現に逆相関することが確認された。