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Analysis of Cell-cell interaction models with CRISPR library

利用 CRISPR 文库分析细胞间相互作用模型

基本信息

批准号：
21K06945
负责人：
倉田盛人
金额：
$ 2.75万
依托单位：
Tokyo Medical and Dental University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K06945/
关键词：
薬剤耐性 CRISPR screening 細胞間相互作用

项目摘要

腫瘍微小環境において、がん幹細胞と間質支持細胞の相互作用により薬剤耐性が誘導されることが知られている。我々は新たな実験系である「間接的CRISPR screening」を確立した。昨年までに、間接的CRISPR screeningにて得られた各候補遺伝子の変異支持細胞を作成し、それらと共培養した白血病細胞株や膵癌細胞株において抗癌剤曝露下で有意に生存・増殖することが確認された。C9orf89、MAGI2、MLPH、RHBDD2の4種のHEK293T 欠損細胞クローンに関して、RNA-sequencingを行った。GSEA解析では、いずれの欠損細胞においてもサイトカイン活性が最も活性化されており、その中でも特にCXCL12の発現が共通して最も上昇していた。定量的PCRおよびELISAの結果よりRHBDD2欠損でのCXCL12発現・分泌上昇が確認された。また、CXCL12中和抗体を用いた共培養・Ara-C曝露実験を行ったところ、HEK293T/UE7T-9 RHBDD2欠損細胞株によるAra-C曝露下でのU937のアポトーシスの抑制が、中和抗体によりキャンセルされた。間質細胞の分泌するCXCL12による腫瘍細胞の薬剤耐性獲得機構として、PI3K-Akt-mTOR経路の活性化が知られている。HEK293T/UE7T-9 RHBDD2欠損細胞とU937を共培養し、Aktのリン酸化を評価した。U937におけるAktのリン酸化は、コントロール共培養群あるいはU937単独培養群と比較して、HEK293T RHBDD2欠損細胞と共培養した際に有意に亢進していた。また、膵癌臨床検体の検討では、間質細胞でのRHBDD2低発現が独立予後不良因子であり、またRHBDD2とCXCX12発現に逆相関することが確認された。

It is now known that drug resistance is induced by the interaction between stem cells and mesenchymal support cells in the microenvironment of tumors. I am new to CRISPR screening. In the past year, indirect CRISPR screening has been used to generate and co-culture different supporting cells for each candidate gene. Leukemia cell lines and cancer cell lines have been identified for intentional survival and proliferation under anti-cancer agent exposure. C9orf89, MAGI2, MLPH, RHBDD2 4 kinds of HEK293T deficient cell cycle, RNA-sequencing GSEA analysis showed that the activity of CXCL12 in the damaged cells was the highest in all cases. Quantitative PCR and ELISA results confirmed the presence and secretion of CXCL12 in RHBDD2 deficient cells. In addition, co-culture and Ara-C exposure with CXCL12 neutralizing antibody were carried out. The inhibition of U937 apoptosis and neutralizing antibody in the HEK293T/UE7T-9RHBDD2 deficient cell line under Ara-C exposure were reported. CXCL12 secretion in stromal cells and the acquisition of drug tolerance in tumor cells. Activation of PI3K-Akt-mTOR pathway HEK293T/UE7T-9 RHBDD2 Defective Cell Line U937 Co-culture and Akt Acidification Evaluation U937 cell co-culture group was intentionally stimulated when compared with HEK293T RHBDD2 cell co-culture group. In the study of clinical manifestations of cancer, low expression of RHBDD2 in stromal cells was identified as an independent adverse factor, and an inverse correlation between RHBDD2 and CXCX12 expression was identified.