BRCA1複合体の中心体制御機構の解析による組織特異的発がん機序の解明

BRCA1複合体による中心体複製制御機構を明らかにするため、本年度はBRCA1複合体構成因子が中心小体複製のどのステップに必要なのかを解析した。BRCA1複合体構成因子であり、中心体複製に必要であることが明らかになっているRACK1をRNAiでノックダウンし、中心小体複製の各段階が進行しうるかを調べた。中心小体複製のマーカーとして、娘中心小体複製の足場として最初期に母中心小体に集族するCEP192およびCEP152、CEP152依存性に活性化したPLK4によってリン酸化され、娘中心小体原基を形成するSTILおよびNEDD1を用いて解析を行った。その結果、RACK1をノックダウンするとSTIL、NEDD1の集族が抑制された。このことから、RACK1が娘中心小体原基の形成ステップで必要であることが示唆された。また、RACK1は複数の残基でリン酸化を受けることが知られている。中心体においてリン酸化されていることが示唆されているセリン残基を変異させ、内在性RACK1をノックダウンした細胞に発現させたところ、STILの集族障害をレスキューできなかった。さらに、同セリン残基のリン酸化ペプチドに対する特異抗体を作成し、免疫染色によってリン酸化RACK1の局在を観察したところ、リン酸化RACK1が中心体に局在し、その局在量は細胞周期によって変動することが明らかになった。これらから、RACK1が中心体制御キナーゼによってリン酸化されることが、娘中心小体原基形成に必要であることが示唆された。さらに、種々の細胞株を用いて解析したところ、RACK1をノックダウンすると乳がん細胞株ではSTILの集族が抑制されるが、乳がん以外の細胞株では抑制されず、娘中心小体原基形成のRACK1依存性は組織特異的であることが示唆された。

BRCA1複合体による中心体複製制御機構を明らかにするため、本年度はBRCA1複合体構成因子が中心小体複製のどのステップに必要なのかを解析した。BRCA1複合体構成因子であり、中心体複製に必要であることが明らかになっているRACK1をRNAiでノックダウンし、中心小体複製の各段階が進行しうるかを調べた。中心小体複製のマーカーとして、娘中心小体複製の足場として最初期に母中心小体に集族するCEP192およびCEP152、CEP152依存性に活性化したPLK4によってリン酸化され、娘中心小体原基を形成するSTILおよびNEDD1を用いて解析を行った。その結果、RACK1をノックダウンするとSTIL、NEDD1の集族が抑制された。このことから、RACK1が娘中心小体原基の形成ステップで必要であることが示唆された。また、RACK1は複数の残基でリン酸化を受けることが知られている。中心体においてリン酸化されていることが示唆されているセリン残基を変異させ、内在性RACK1をノックダウンした細胞に発現させたところ、STILの集族障害をレスキューできなかった。さらに、同セリン残基のリン酸化ペプチドに対する特異抗体を作成し、免疫染色によってリン酸化RACK1の局在を観察したところ、リン酸化RACK1が中心体に局在し、その局在量は細胞周期によって変動することが明らかになった。これらから、RACK1が中心体制御キナーゼによってリン酸化されることが、娘中心小体原基形成に必要であることが示唆された。さらに、種々の細胞株を用いて解析したところ、RACK1をノックダウンすると乳がん細胞株ではSTILの集族が抑制されるが、乳がん以外の細胞株では抑制されず、娘中心小体原基形成のRACK1依存性は組織特異的であることが示唆された。