Development of novel gene therapy for MELAS by editing mitochondorial DNA

ミトコンドリア脳筋症・乳酸アシドーシス・脳卒中様発作症候群(= MELAS) は母系遺伝をするミトコンドリア病の一つで、mtDNAのA3243G, A3252G, G13513A等の点変異が原因で発症することが知られている。MELASの発症時期や重篤度なども多様であり、その複雑な臨床像を反映する病態メカニズムは推測の域を出ておらず、確立された治療法は存在していない。本研究は、MELAS患者由来iPS細胞とMELASモデルマウス(Mito-mice)を用いて、その病態機構の解明と革新的な遺伝子治療法の開発を目的としている。前年度はmitochondria DNAにA2748G変異を持つ mito-mice（mit-A2748G-mice）に対するTALEN pairsの作成を行った。最初にSSA assayにより幾つかのTALEN pairの候補を見いだした。その後このmito-miceの作成に利用された変異mtDNA（A2748G変異）を有するmouse ES cellで同様に検討し更に候補を絞った。1)N末端側のTALEを1塩基変異させて、その特異性を上げる。2)発現ベクターのコドンを改変する。といった工夫を行い、これにより最終的にheteroplasmyが80％あったmouse ES cellにTALEN pairsをtranfectしてやると。30％まで軽減させることができ、大変効率の良いTALEN pairの作成に成功した。本年度はこの効率の良いTALEN pairsを発現するAAVベクター（mit-TALEN-AAV）の作成を行い。既に完了した。現在このmit-TALEN-AAVを現在mit-A2748G-miceの大腿四頭筋に筋肉注射し、骨格筋でのheteroplasmyを改善できるかどうかを検討している。

ミトコンドリア脳筋症・乳酸アシドーシス・脳卒中様発作症候群(= MELAS) は母系遺伝をするミトコンドリア病の一つで、mtDNAのA3243G, A3252G, G13513A等の点変異が原因で発症することが知られている。MELASの発症時期や重篤度なども多様であり、その複雑な臨床像を反映する病態メカニズムは推測の域を出ておらず、確立された治療法は存在していない。本研究は、MELAS患者由来iPS細胞とMELASモデルマウス(Mito-mice)を用いて、その病態機構の解明と革新的な遺伝子治療法の開発を目的としている。前年度はmitochondria DNAにA2748G変異を持つ mito-mice（mit-A2748G-mice）に対するTALEN pairsの作成を行った。最初にSSA assayにより幾つかのTALEN pairの候補を見いだした。その後このmito-miceの作成に利用された変異mtDNA（A2748G変異）を有するmouse ES cellで同様に検討し更に候補を絞った。1)N末端側のTALEを1塩基変異させて、その特異性を上げる。2)発現ベクターのコドンを改変する。といった工夫を行い、これにより最終的にheteroplasmyが80％あったmouse ES cellにTALEN pairsをtranfectしてやると。30％まで軽減させることができ、大変効率の良いTALEN pairの作成に成功した。本年度はこの効率の良いTALEN pairsを発現するAAVベクター（mit-TALEN-AAV）の作成を行い。既に完了した。現在このmit-TALEN-AAVを現在mit-A2748G-miceの大腿四頭筋に筋肉注射し、骨格筋でのheteroplasmyを改善できるかどうかを検討している。