Functional analysis of disease susceptibility gene RAP1A using organoid monolayer from Crohn's Disease

点击翻译按钮获取中文摘要

前年度までにクローン病患者の回腸上皮粘膜のオルガノイド単層培養法を確立したため、本年度は対象症例数をさらに増やした。最終的には約３０症例でオルガノイドの樹立に成功した。単層培養を用いた抵抗値の検証には、安定的、かつ再現性のある実験系の構築が望まれるため、まずは条件設定を行った。Millicell 電気抵抗値測定システムを用いて単層培養のTEERを測定したところ、経時的にTEERは上昇し、樹立３日後はTEER:200Ωcm2程度だったものが、５日目では400Ωcm2、10日後は1000Ωcm2、17日目で1400Ωcm2程度のピークとなり、以降細胞の死滅とともにTEERの低下を確認できた。複数の条件を検証することで、樹立後10日が最も検証に適した状態と判断した。その後、様々な因子によりTEERが変動するかどうかを検証した。最初に行ったのが、炎症性腸疾患に関連するサイトカインを負荷し、負荷後の粘膜抵抗値を検出することである。まずは、腸内細菌をターゲットとし、LPS(1ng/ml)の負荷を試みた。LPS負荷とコントロールには電気抵抗値に差を認めず、LPSはクローン病上皮の粘膜電気抵抗値に関与しないことを明らかとした。次に、TNFα、およびインターフェロンの負荷を行った。24時間負荷することで、抵抗値はコントロールと比較して約40%まで低下することが明らかとなり、IBD関連の炎症性サイトカインが、腸管上皮細胞の粘膜電気抵抗の低下を惹起することがあきらかとされた。次年度は、RAP1A遺伝子多型によるTEERの変動について検証する予定である。