Functional analysis of disease susceptibility gene RAP1A using organoid monolayer from Crohn's Disease

使用克罗恩病的类器官单层对疾病易感基因 RAP1A 进行功能分析

• 批准号: 21K07931
• 负责人: 諸井 林太郎
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: Tohoku University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K07931/
• 关键词: RAP1A; オルガノイド; 単層培養; タイトジャンクション; クローン病

前年度までにクローン病患者の回腸上皮粘膜のオルガノイド単層培養法を確立したため、本年度は対象症例数をさらに増やした。最終的には約３０症例でオルガノイドの樹立に成功した。単層培養を用いた抵抗値の検証には、安定的、かつ再現性のある実験系の構築が望まれるため、まずは条件設定を行った。Millicell 電気抵抗値測定システムを用いて単層培養のTEERを測定したところ、経時的にTEERは上昇し、樹立３日後はTEER:200Ωcm2程度だったものが、５日目では400Ωcm2、10日後は1000Ωcm2、17日目で1400Ωcm2程度のピークとなり、以降細胞の死滅とともにTEERの低下を確認できた。複数の条件を検証することで、樹立後10日が最も検証に適した状態と判断した。その後、様々な因子によりTEERが変動するかどうかを検証した。最初に行ったのが、炎症性腸疾患に関連するサイトカインを負荷し、負荷後の粘膜抵抗値を検出することである。まずは、腸内細菌をターゲットとし、LPS(1ng/ml)の負荷を試みた。LPS負荷とコントロールには電気抵抗値に差を認めず、LPSはクローン病上皮の粘膜電気抵抗値に関与しないことを明らかとした。次に、TNFα、およびインターフェロンの負荷を行った。24時間負荷することで、抵抗値はコントロールと比較して約40%まで低下することが明らかとなり、IBD関連の炎症性サイトカインが、腸管上皮細胞の粘膜電気抵抗の低下を惹起することがあきらかとされた。次年度は、RAP1A遺伝子多型によるTEERの変動について検証する予定である。

In the past year, the number of cases of ileal epithelial membrane in patients with common diseases has increased, and the number of cases in this year has increased. Finally, about 30 cases were successfully established. Single layer culture can be used to evaluate resistance, stability, reproducibility, and system construction. Millicell's electrical resistance was measured in single layer culture. TEER increased at 3 days, TEER increased at 400 Ω cm2 at 5 days, TEER decreased at 1000 Ω cm2 at 17 days, TEER decreased at 10 days, TEER decreased at 3 days. The condition of the test is determined 10 days after the test is established. After the test, the TEER was tested. The initial diagnosis of inflammatory bowel disease is related to stress and post-stress mucosal resistance. The load of LPS(1ng/ml) on the intestinal bacteria was tested. LPS load is related to the difference in electrical resistance of the mucosa. Second, TNFα, TNF α24. The time load on the intestinal mucosa is about 40%. The resistance is lower than that on the intestinal mucosa. The inflammatory response associated with IBD is lower than that on the intestinal mucosa. In the next year, RAP1A gene polymorphism was detected by TEER.