Cx45R75H変異疾患特異的iPS心筋細胞の性質に関する検討

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コネキシン45（Cx45）は、胎生期の心臓で最初に発現するCxである。出生後はその発現部位が刺激伝導系に限局し、構成するチャネルの単位電流は、心筋細胞に発現する別のコネキシン、Cx43やCx40よりも小さく、その役割については不明な点が多く、遺伝子異常の報告もなかった。本研究の目的は、我々が最近発見した、家族性の心臓伝導障害と骨・歯牙異常を呈する家族で発見されたCx45R75H変異の機能を調べ、その病態機序を解明し、治療につなげることである。本年度は、患者3症例と健常者複数のiPS細胞について、複数のサブ系列のiPS細胞を樹立し、個別に培養維持し、心筋細胞への分化し易さの検討を行い、心筋細胞への分化に向くサブ系列を決定した。さらに、健常者iPS細胞のコネキシン遺伝子のノックアウト、患者iPS細胞のコネキシン45のR75H（G224A）変異の修復、健常者iPS細胞のコネキシン遺伝子にG224A変異の導入を目的として、ゲノム編集実験を進めた。これまでに、コネキシン遺伝子の所定の位置でゲノムを切断するためのガイドになるgRNAと切断酵素であるCas9を発現するプラスミドコンストラクトを作成し、これを用いて健常者コネキシン45遺伝子のノックアウト（11塩基の欠損）iPS細胞を得た。現在、患者iPS細胞のコネキシン45のG224A変異の修復、健常者iPS細胞のコネキシン遺伝子にG224A変異の導入のための１塩基置換をターゲットとしたゲノム編集実験を進めている。