Investigation for clinical application of phospholipase D4 in autoimmune diseases

A. 血漿中遊離型PLD4の定量ヒト血漿サンプル中の遊離型PLD4を定量し、自己免疫疾患患者と健常者を比較し、臨床的バイオマーカーとなる可能性を追求した。抗ヒトPLD4抗体でELISA系を樹立し、大腸菌由来リコンビナントPLD4をサンプルとした測定系では定量性を持って計測された。他方でヒト血漿検体では段階希釈法で定量性が確認されなかった。ELISA系が適正に働かない原因とし、① 夾雑する他の血漿由来タンパクによる反応阻害、② 使用した抗ヒトPLD4抗体が哺乳類細胞由来PLD4を認識しない可能性を挙げた。まずは後者の抗原抗体反応の適正性を確認するため、PLD4を遺伝子導入したHEK293Tのライセートを用いウェスタンブロットを行った結果、使用した抗ヒトPLD4抗体と哺乳動物細胞発現のPLD4に反応性が確認された。現在は、上記ELISA法の陽性対照とするため、遊離型PLD4を模した分泌型免疫グロブリン定常領域融合PLD4発現ベクターをHEK293Tに遺伝子導入し、タンパク発現を確認した状況である。B. 患者末梢血単核球（PBMC）におけるPLD4発現プロファイルの計測ヒトPBMCにおいて、PLD4トランスクリプトはB細胞、単球に選択的に発現するが、健常者と疾患患者の間で差異は認めなかった（2022年度報告）。他方、樹状細胞（DCs）をconventional DCsと形質細胞様樹状細胞（pDCs）を亜分画した結果、pDCsはB細胞、単球に比してPLD4を多く発現することが判明した。pDCs、B細胞、単球は共通してトール様受容体（TLR）7、9を高発現し、一本鎖DNAやRNAを認識し、免疫応答を駆動する。現在は単離したヒトB細胞、単球、pDCsをTLR7、TLR9リガンド存在下で培養し、PLD4トランスクリプト発現を定量する計画である。

A. 血漿中遊離型PLD4の定量ヒト血漿サンプル中の遊離型PLD4を定量し、自己免疫疾患患者と健常者を比較し、臨床的バイオマーカーとなる可能性を追求した。抗ヒトPLD4抗体でELISA系を樹立し、大腸菌由来リコンビナントPLD4をサンプルとした測定系では定量性を持って計測された。他方でヒト血漿検体では段階希釈法で定量性が確認されなかった。ELISA系が適正に働かない原因とし、① 夾雑する他の血漿由来タンパクによる反応阻害、② 使用した抗ヒトPLD4抗体が哺乳類細胞由来PLD4を認識しない可能性を挙げた。まずは後者の抗原抗体反応の適正性を確認するため、PLD4を遺伝子導入したHEK293Tのライセートを用いウェスタンブロットを行った結果、使用した抗ヒトPLD4抗体と哺乳動物細胞発現のPLD4に反応性が確認された。現在は、上記ELISA法の陽性対照とするため、遊離型PLD4を模した分泌型免疫グロブリン定常領域融合PLD4発現ベクターをHEK293Tに遺伝子導入し、タンパク発現を確認した状況である。B. 患者末梢血単核球（PBMC）におけるPLD4発現プロファイルの計測ヒトPBMCにおいて、PLD4トランスクリプトはB細胞、単球に選択的に発現するが、健常者と疾患患者の間で差異は認めなかった（2022年度報告）。他方、樹状細胞（DCs）をconventional DCsと形質細胞様樹状細胞（pDCs）を亜分画した結果、pDCsはB細胞、単球に比してPLD4を多く発現することが判明した。pDCs、B細胞、単球は共通してトール様受容体（TLR）7、9を高発現し、一本鎖DNAやRNAを認識し、免疫応答を駆動する。現在は単離したヒトB細胞、単球、pDCsをTLR7、TLR9リガンド存在下で培養し、PLD4トランスクリプト発現を定量する計画である。