Investigation for clinical application of phospholipase D4 in autoimmune diseases

磷脂酶D4在自身免疫性疾病中的临床应用探讨

• 批准号: 21K08475
• 负责人: 秋月 修治
• 金额: $ 2.25万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K08475/
• 关键词: 自己免疫疾患; ホスホリパーゼD4; トール様受容体; 全身性自己免疫疾患

A. 血漿中遊離型PLD4の定量ヒト血漿サンプル中の遊離型PLD4を定量し、自己免疫疾患患者と健常者を比較し、臨床的バイオマーカーとなる可能性を追求した。抗ヒトPLD4抗体でELISA系を樹立し、大腸菌由来リコンビナントPLD4をサンプルとした測定系では定量性を持って計測された。他方でヒト血漿検体では段階希釈法で定量性が確認されなかった。ELISA系が適正に働かない原因とし、① 夾雑する他の血漿由来タンパクによる反応阻害、② 使用した抗ヒトPLD4抗体が哺乳類細胞由来PLD4を認識しない可能性を挙げた。まずは後者の抗原抗体反応の適正性を確認するため、PLD4を遺伝子導入したHEK293Tのライセートを用いウェスタンブロットを行った結果、使用した抗ヒトPLD4抗体と哺乳動物細胞発現のPLD4に反応性が確認された。現在は、上記ELISA法の陽性対照とするため、遊離型PLD4を模した分泌型免疫グロブリン定常領域融合PLD4発現ベクターをHEK293Tに遺伝子導入し、タンパク発現を確認した状況である。B. 患者末梢血単核球（PBMC）におけるPLD4発現プロファイルの計測ヒトPBMCにおいて、PLD4トランスクリプトはB細胞、単球に選択的に発現するが、健常者と疾患患者の間で差異は認めなかった（2022年度報告）。他方、樹状細胞（DCs）をconventional DCsと形質細胞様樹状細胞（pDCs）を亜分画した結果、pDCsはB細胞、単球に比してPLD4を多く発現することが判明した。pDCs、B細胞、単球は共通してトール様受容体（TLR）7、9を高発現し、一本鎖DNAやRNAを認識し、免疫応答を駆動する。現在は単離したヒトB細胞、単球、pDCsをTLR7、TLR9リガンド存在下で培養し、PLD4トランスクリプト発現を定量する計画である。

A. Quantification of free PLD 4 in plasma, comparison of free PLD4 in patients with immune disorders and normal subjects, and pursuit of clinical possibility Anti-PLD4 antibody ELISA system was established, and the origin of E. coli was detected quantitatively. Other methods for quantitative confirmation of plasma levels ELISA is the appropriate reason for this,(1) inhibition of other plasma origin,(2) recognition of mammalian cell origin by using anti-PLD4 antibodies. To confirm the antigenicity of anti-PLD4 antibody in HEK293T and its antigenicity in mammalian cells. Now, the positive response of ELISA method described above, free PLD4 model, secretory immune system, constant domain fusion PLD4 detection, HEK293T gene introduction, detection and confirmation of the status. B. The detection of PLD4 in peripheral blood mononuclear cells (PBMC) of patients was measured by PBMC, PLD4 in B cells and PBMC, and differences in the detection of PLD4 in healthy patients with diseases were recognized (2022 Annual Report). Other dendritic cells (DCs) and morphological dendritic cells (pDCs) were identified as a result of the analysis, and pDCs were identified as B cells and PLDs. pDCs, B cells, and lymphocytes share a common receptor (TLR) 7, 9, and a unique DNA and RNA recognition and immune response. The present study aims to quantify the development of isolated B cells, lymphocytes, and pDCs in the presence of TLR7 and TLR9.