肝細胞がん多段階発がんにおけるWNTパスウェイ活性化メカニズムの解明

阐明肝细胞癌多步癌变过程中WNT通路激活机制

• 批准号: 21K08807
• 负责人: 緑川 泰
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: National Center of Neurology and Psychiatry
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K08807/
• 关键词: 肝細胞癌; WNTパスウェイ; ベータカテニン; E-カドヘリン; 細胞悪性度; 多段階発がん; 次世代シーケンサー

昨年度までに行ったシーケンスによる8種類の肝がん細胞株についてベータカテニンの遺伝子異常については以下の通りである。ベータカテニンmut:HepG2, Hep3B, PLC/PRF/5, HLEベータカテニンWT: Huh7, SH-Hep1CDH1を強制発現させるために現在まで以下の実験を遂行している。すなわちCDH1の転写領域全長（2,807bp）をpCDH-EF1-T2A-Puro（レンチウィルスベクター）にサブクローニングした。さらに上記のベータカテニンmut の各細胞株にトランスフェクションすることによりE-カドヘリンの発現を誘導し、48時間後に免疫染色によりE-カドヘリンの細胞膜への局在でトランスフェクションの効率については判定した。CDH1発現によるベータカテニンの核への移行の影響についても、免疫染色によりトランスフェクション前後の細胞株を比較検討を行い、高い高率でトランスフェクションが行われていることを確認した。CTNNB1 mut過剰発現についてもベータカテニンmutを有する細胞株HepG2よりCTNNB1の全長（3,488bp）をサブクローニングした後、トランスフェクションは上記の方法でベータカテニンWT細胞株に行った。さらにこれらのDNA導入した細胞株についてsiRNAによりCDH1をノックダウンすることによりカテニンの核への移行を確認する予定である。上記で作成した肝がん細胞について、今年度中にRNAシーケンスによりWNT下流遺伝子の発現レベルの 化、WNTパスウェイの活性化を確認する予定である。さらに、上記で作成した細胞株についてそれぞれカドヘリン発現の有無で細胞 殖能、細胞遊走能、細胞浸潤能などを比較し、肝がん細胞の 性化について比較検討する予定である。

8 kinds of liver cell lines in the past year The following actions are carried out in the event of stress:HepG2, Hep3B, PLC/PRF/5, HLE, WT: Huh7, SH-Hep1CDH1. The full length of CDH1's write domain (2,807bp) is pCDH1-T2A-Puro. In addition, the expression of E-protein in each cell line was induced and determined by immunostaining after 48 hours. CDH1 expression was confirmed by comparing the cell lines before and after CDH1 expression with immunostaining. CTNNB1 mut over-expression was detected in HepG2, a cell line with the full length of CTNB1 (3,488 bp). In addition, the DNA introduced into the cell line can be used to confirm the migration of CDH1. The above notes indicate that the development and activation of WNT downstream genes and WNT downstream genes in the middle of this year will be confirmed. In addition, the cell lines described above were prepared and compared with each other in terms of cell proliferation, cell migration, cell infiltration, and liver cell characterization.