肺がんの抗がん剤抵抗性に関与する新規遺伝子の同定を目指したRNA修飾酵素の解析

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本年度は、日本人由来のヒト扁平上皮癌細胞株 RERF-LC-AIに対して、ドセタキセルおよびペメトレキセドを添加培養した時の、RNA修飾酵素の発現レベルをqPCRで解析した。RERF-LC-AIにドセタキセルおよびペメトレキセドを100ｎMの濃度でそれぞれ添加して、48時間培養し、細胞からtotal RNAを抽出し、代表的な12種類のRNA修飾酵素の遺伝子発現レベル(AHCY、ALKBH5、FTO、HENMT1、HNRNPC、NSUN2、PNP、RNMT、TRMT6、TRMT61A、YTHDF2、METTL3) をqPCRで解析した。ドセタキセルの添加では、12種類の遺伝子のうちAHCY、FTO、TRMT61A、YTHDF2の4種類の遺伝子の発現がコントロールに比べ10倍以上上昇した。ペメトレキセドの添加では12種類の遺伝子のうちAHCY、FTO、HENMT1、HNRNPCの4種類の遺伝子の発現がコントロールに比べ10倍以上上昇した。発現が上昇した4種類の遺伝子（AHCY、FTO,YTHDF2、TRMT61A）を個別にノックダウンする為に、遺伝子の標的配列をin silico解析から、個々の遺伝子に対して3種類ずつ選択し、shRNAウイルスベクターを作製した。