頚動脈石灰化粥腫安定機構の多角的エピジェネティック制御と分子間クロストークの探究

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これまでに明らかにしてきた網羅的検索による血管新生抑制遺伝子のmRNA, タンパク発現増強、ゲノムの配列異常(SNV)、エピゲノムのDNAメチル化異常やmicroRNAによる頚動脈粥腫安定化機構研究を発展させ、本研究では、とくに複雑な影響を及ぼす可能性のあるエピゲノムによる頚動脈粥腫安定化・不安定化の調節、相互作用をさらに多角的に究明するため、ATAC-Seq, ChIP-Seq, Hi-C法を用い、アガツトンカルシウムスコアによる分類を基準としてヒト頚動脈で探求することを計画したが、令和3年度は、ヒト頚動脈粥腫として頚動脈内膜剥離術によって摘出した標本（-80℃凍結）を用い、石灰化含有度の評価は術前MDCTAで計測したカルシウムスコアおよびHE染色組織標本で行い、高石灰化と低石灰化粥腫群に分類した。超音波破砕で細胞を回収後、非イオン性活性剤で核を単離し、得られたクロマチンをTn5トランスポゼースにより、NGSシーケンスアダプタを標識しつつ断片化、ライブラリー調整後、PCRで増幅しNGSで解析し、MACSでpeakcallを検出、annotation付加し、Viewerで可視化後シーケンスリードによりクロマチン・アクセシビリティが高い領域、すなわち遺伝子の転写が活発に行われていると推測されるユークロマチン領域を検出するATAC-Seqを行い、オープンクロマチン領域にみられる塩基配列を網羅的に解析し、クロマチン・アクセシビリティの高・低石灰化粥腫群での差異を明らかにすることを計画し、まずvalidation studyを行った。慎重を期すため、令和4年度には異なる複数の検体で二度に渡ってvalidationを反復した。