Translational control in skeletal muscle regeneration

骨骼肌再生的转化控制

• 批准号: 21K09218
• 负责人: 椎森 仁美
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: Nara Institute of Science and Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K09218/
• 关键词: 骨格筋; 翻訳制御; CNOT4; ユビキチン転移酵素; 骨格筋再生; RNA

骨格筋筋線維の修復・再生過程は、運動機能のみならず個体の発生や恒常性維持に重要な役割を果たす。しかしながら、骨格筋修復・再生時における各素過程の分子基盤は未だ明らかではない。申請者はこれまでの研究から、遺伝子発現制御因子CCR4-NOT複合体の構成因子、ユビキチン転移酵素CNOT4がmRNA翻訳制御を介して、骨格筋修復・再生に機能する可能性を見出した。そこで、本研究では、骨格筋の修復・再生過程におけるCNOT4のユビキチン化標的因子とそれらによる翻訳制御機構の全体像を明らかにすることを目指して研究を進めている。令和4年度は、マウス筋芽細胞C2C12の野生型及びCNOT4ノックアウト株を用いて、C2C12細胞の分化誘導時におけるユビキチン化タンパク質検出系の確立を試みた。内在性のユビキチン化タンパク質のpull-downが可能である人工タンパク質を用いて解析を進めたが、発現レベルが低い内在のタンパク質については、そのユビキチン化は検出できなかった。そのため、トランスフェクション効率が高いHEK293T細胞を用いて翻訳関連因子のCNOT4依存的なユビキチン化状態の解析を行い、翻訳開始抑制因子である4E-BP1や4E-TがCNOT4依存的にユビキチン化されていることを明らかにした。さらに、筋分化の過程でのCNOT4の挙動をユビキチン化標的タンパク質を詳細に解析するため、マウスES細胞を用いたMyoD発現誘導による骨格筋細胞への分化系を確立し、解析を進めている。

骨骼肌肌肉纤维的修复和再生不仅在运动功能中，而且在个体的发展和维持稳态方面都起着重要作用。但是，在骨骼肌修复和再生过程中每个基本过程的分子基础尚不清楚。从以前的研究中，申请人发现了泛素转移酶CNOT4是基因表达调节因子CCR4的组成因子CCR4不复合物的可能性，可以通过mRNA翻译控制在骨骼肌修复和再生中起作用。因此，这项研究正在进行中，目的是阐明在修复和再生骨骼肌及其翻译机制期间CNOT4泛素化目标因素的整体情况。在2022年，我们尝试使用野生型和CNOT4敲除C2C12的野生型和CNOT4敲除菌株在C2C12细胞诱导过程中建立泛素化蛋白检测系统。使用人工蛋白质进行分析，该蛋白可以下拉内源性泛素化蛋白，但未检测到具有低表达水平的内源性蛋白的泛素化。因此，我们使用具有高转染效率的HEK293T细胞分析了与翻译相关因素的CNOT4依赖性泛素化状态，并揭示了以CNOT4依赖性方式泛滥翻译起始抑制器4E-BP1和4E-T。此外，为了详细分析肌肉分化过程中CNOT4的行为，我们通过使用小鼠ES细胞诱导MYOD表达来建立分化系统到骨骼肌细胞中，并正在分析它。