次世代型移植用網膜シート作製のための分子基盤の確立

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昨年度実施したタイプA~CのスフェロイドのシングルセルRNAseqの解析を引き続き行った。今年度は特にタイプAとCに注目し、網膜層構造の形成に重要な因子の同定に焦点をあて、解析を行った。タイプAとCのそれぞれについて、全てのタイムポイントのデータを統合し、UMAPを作製したところ、両者は共に網膜色素上皮（RPE）、網膜神経節細胞、二次ニューロン細胞、視細胞前駆細胞、網膜前駆細胞のクラスターから構成されており、構成細胞種に明確な違いは確認できなかった。より詳細に検討するため、ソート直前（Day0）のデータについてタイプAを形成する細胞集団とタイプBおよびCを形成する細胞集団（タイプBとCは同一の細胞集団からソート条件の違いで生まれる）を統合し、比較した結果、特定のクラスターを構成する細胞数に大きな違いを認めた。しかし網膜前駆細胞マーカーであるRXの発現に注目してみると、これらの細胞集団間で明確な差が確認できなかった。このことは分化初期において網膜前駆細胞の割合に両者で大きな差がないことを示唆している。次に移植のタイミングであるDay35において同様の解析を行ったところ、一部のクラスターでタイプAとタイプCの間で細胞数に差があることが確認できた。しかし一方に特異的なクラスターは形成されず、両者が比較的似ていることが示唆された。次にスフェロイドで層構造が形成され始めるDay5と9において解析を行なった。特に網膜前駆細胞に注目し、両者で比較したところ、タイプCで特に細胞数が多いクラスターの存在が明らかになった。そのクラスターを詳細に検討すると、Day5ではWnt2bが、Day9ではWnt5aが特異的に発現していることが示唆された。Wnt経路は網膜の層構造に重要な役割を果たしていることが知られている。また、タイプA、B、Cのスフェロイドを免疫不全網膜変性ラットに移植した。