自家移植を目指した機能性エクリン汗腺を含有する三次元培養表皮の開発

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本研究の目的は、現在までに改良されてきた皮膚三次元培養表皮をさらに進化させ、機能性エクリン汗腺を含有する三次元培養皮膚の新規作成法を確立し、臨床応用を目指すことである。我々は、さらにエクリン汗腺の機能を有する次世代型の表皮シートあるいは自家培養皮膚の開発を目指す点において独自性・独創性がある。今回我々は、将来の基礎研究及び臨床応用に十分に貢献できる次世代型の三次元培養皮膚モデルの作製を目指すが、その結果を国内国外へ発信することで、多数の皮膚疾患患者に対する臨床応用へ発展されていくことを強く切望する。多指症患者から得られた指尖部より、エクリン汗腺を維持中に増殖した汗管、汗腺細胞を単離培養し、含有される幹細胞の同定・単離をlabel retaining法及び免疫染色にて行う。胎性幹細胞からの角化細胞への誘導についてはFAD培地にて培養し、その後BMPとアスコルビン酸添加することによりケラチン陽性細胞を誘導、さらに角化細胞用培地に変更し角化細胞の増殖を高め、継代することにより間葉系細胞の割合を減らしていく方法で、全経過として約1ヶ月以上を要する。表皮幹細胞が存在する基底層に多いK5陽性細胞の分離条件などを参考にして細胞を単離する。分離後再増殖させた単離細胞内での多能性幹細胞（PSC）は、フローサイトメトリーによりTRA-1-60、TRA-1-81、SSEA3などのマーカーによりソーティングにて同定・回収する。免疫染色することにより増殖した細胞の性質を確認する。エクリン汗管細胞及び腺房細胞を、オルガノイド培養法・マトリゲル培養にてスフェロイド培養を行なう。その後エクリン汗腺細胞から組織への分化誘導を行うために、ヒト角化細胞を用いた単層培養あるいは三次元培養表皮形成中にエクリン汗腺のスフェロイドを挿入し共培養を行い、正常皮膚同様に気相内での表皮内汗管形成誘導を行なう。