口腔細菌の薬剤耐性化および各種抗生剤に対する交叉耐性獲得の網羅的検索

点击翻译按钮获取中文摘要

令和３年度は、Enterococcus faecalis ATCC29212に対するクロルヘキシジン塩酸塩の最小発育阻止濃度（MIC）をmicro dilution assayにて測定し、MIC判定時に増殖が認められたもののうち、最大濃度のクロルヘキシジン塩酸塩を含む細菌懸濁液を用いてEnterococcus faecalis ATCC29212を再度調整し、28回まで最小発育阻止濃度測定を繰り返した。その結果、クロルヘキシジン塩酸塩への28回暴露を繰り返し続けることにより、E. faecalis ATCC29212に対するクロルヘキシジンの最小発育阻止濃度は増加し、クロルヘキシジン耐性E. faecalis ATCC29212株を作成することに成功した。令和4年度は、まず、PCRおよびリアルタイムPCRによりクロルヘキシジン耐性株と野生株のリボソームRNA配列を解析したところ、両菌株間で同様のリボソームRNA配列を持っていたことから、28回の継代培養を行ってもクロルヘキシジン耐性株に他種細菌の混入は認められないことを確認した。つづいて、RNAシークエンスにより、クロルヘキシジン耐性による遺伝子発現の変化を解析するため、クロルヘキシジン耐性株および野生株から抽出したトータルRNAサンプルから、rRNA除去法によりストランド特異的cDNAライブラリを調整し、Illumina NovaSeq 6000を用いて1サンプルあたり1400-1800万の150 bpペアエンドシーケンスリードを取得した。これらのPE FASTQファイルをさらにTrimmomaticを用いてトリミングした後、HISAT2によるシーケンスリードのマッピングを行い、featureCountsによる遺伝子ごとのリードカウントを経て、DESeq2による発現変動遺伝子の解析を行った。