miRNAを用いた転写因子制御による歯周組織関連細胞の分化誘導

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歯周治療中に抜歯となった歯の歯根膜を採取し、ヒト歯根膜線維芽細胞（HPDL)を 抽出し、10%ウシ胎児血清（FBS）および１％ペニシリン－ストレプトマイシンを含むDMEMを用いて継代３～６までHPDLを培養した。また、歯周組織構成細胞（特に歯肉線維芽細胞（HGF）および歯根膜線維芽細胞（HPDL)）で骨芽細胞より優位に発現しているTwist２およびKlf12の３'-UTRに結合するmiRNAを公開データベースのTargetScanにて検索し、両遺伝子の3'-UTRに結合するmirRNAはmir141および200aであることを確認した。次に、mi141および200aが結合するTwist２およびKlf12の３'-UTR をPGL3 promoterルシフェラーゼプラスミドに挿入し、シークエンス解析を行い、正しい配列が挿入されたか確認した。正しい配列が挿入されたルシフェラーゼプラスミドを挿入したHPDLはmi141または200aを細胞内に４時間導入後、10%FBSを含むDMEMで68時間細胞培養し回収後にルシフェラーゼ活性を計測すると活性は抑制された。さらに、HPDLを様々な大きさのディッシュに播種し、mir141または200aを細胞内に4時間導入後、10%FBSを含むDMEMで68時間細胞培養したHPDLを回収し、全RNAおよびタンパク質を抽出し、間葉系細胞に発現する転写因子RNAおよびタンパク質量をReal-time PCRおよびWestern Blotにて検索を行った結果、Twist2およびKlf12mRNAおよびタンパク質量を減少させ、Sox5、Sox6およびTrips1 mRNAを増加させ、Sox5およびSox6タンパク質を増加させた。さらに、mir141または200aを過剰発現させた細胞で、軟骨分化マーカーのACANmRNAの増加および線維化マーカーのCOL1A1 ｍRNAの減少を引き起こし、細胞はアルシアンブルー染色で青く染色された。このことから、HPDLを軟骨細胞様細胞に分化誘導させた。