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miRNAを用いた転写因子制御による歯周組織関連細胞の分化誘導

利用miRNA的转录因子控制诱导牙周组织相关细胞的分化

基本信息

批准号：
21K09922
负责人：
高井英樹
金额：
$ 2.16万
依托单位：
Nihon University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K09922/
关键词：
miRNA 転写因子分化誘導

项目摘要

歯周治療中に抜歯となった歯の歯根膜を採取し、ヒト歯根膜線維芽細胞（HPDL)を抽出し、10%ウシ胎児血清（FBS）および１％ペニシリン－ストレプトマイシンを含むDMEMを用いて継代３～６までHPDLを培養した。また、歯周組織構成細胞（特に歯肉線維芽細胞（HGF）および歯根膜線維芽細胞（HPDL)）で骨芽細胞より優位に発現しているTwist２およびKlf12の３'-UTRに結合するmiRNAを公開データベースのTargetScanにて検索し、両遺伝子の3'-UTRに結合するmirRNAはmir141および200aであることを確認した。次に、mi141および200aが結合するTwist２およびKlf12の３'-UTR をPGL3 promoterルシフェラーゼプラスミドに挿入し、シークエンス解析を行い、正しい配列が挿入されたか確認した。正しい配列が挿入されたルシフェラーゼプラスミドを挿入したHPDLはmi141または200aを細胞内に４時間導入後、10%FBSを含むDMEMで68時間細胞培養し回収後にルシフェラーゼ活性を計測すると活性は抑制された。さらに、HPDLを様々な大きさのディッシュに播種し、mir141または200aを細胞内に4時間導入後、10%FBSを含むDMEMで68時間細胞培養したHPDLを回収し、全RNAおよびタンパク質を抽出し、間葉系細胞に発現する転写因子RNAおよびタンパク質量をReal-time PCRおよびWestern Blotにて検索を行った結果、Twist2およびKlf12mRNAおよびタンパク質量を減少させ、Sox5、Sox6およびTrips1 mRNAを増加させ、Sox5およびSox6タンパク質を増加させた。さらに、mir141または200aを過剰発現させた細胞で、軟骨分化マーカーのACANmRNAの増加および線維化マーカーのCOL1A1 ｍRNAの減少を引き起こし、細胞はアルシアンブルー染色で青く染色された。このことから、HPDLを軟骨細胞様細胞に分化誘導させた。

Dentist root membrane was collected during the treatment, and HPDL was extracted from the root membrane. 10% fetal serum (FBS) and 1% HPDL were used to culture the root membrane. It was confirmed that miRNA bound to the 3'-UTR of Twist2 and Klf12 in the cells constituting the bone and peridental tissues (HGF and HPDL) was detected by TargetScan and miRNA bound to the 3'-UTR of Twist2 and Klf12 in mirRNA 141 and 200a. Next, mi141 and mi 200a are combined with Twist2 and Klf12's 3'-UTR and PGL3 promoter is included in the list of products. After 4 hours of cell culture with 10% FBS and 68 hours of cell culture with 10% FBS, the activity of HPDL mi141 was measured. In addition, HPDL was cultured in DMEM containing 10% FBS for 68 hours after 4 hours of intracellular introduction, and HPDL was recovered. Total RNA and protein were extracted. The expression of RNA and protein in mesenchymal cells was detected by Real-time PCR and Western Blot. The quality of Twist2 and Klf12mRNA was reduced. SOX5, SOX6 and TRIPS1 mRNA increased, SOX5 and SOX6 mRNA increased. In addition, mir141 mRNA was detected in 200a cells, cartilage differentiation, ACAN mRNA increased, and maintenance, COL 1A1 mRNA decreased. HPDL chondrocytes are differentiated into cells.