シングルセル解析による体節形成の多様性を統合する分子基盤の解明

通过单细胞分析阐明整合体节形成多样性的分子基础

基本信息

批准号：
20K06676
负责人：
小田康子
金额：
$ 2.83万
依托单位：
Osaka Medical and Pharmaceutical University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2020
资助国家：
日本
起止时间：
2020-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究では、オオヒメグモ胚を用いてシングルセルRNA-seq解析を行い、体節形成の基盤となる縞パターン形成時の遺伝子発現を単一細胞レベルで理解することを目指している。昨年度までに、遺伝子発現の情報が蓄積している胚盤期の胚を用いて単一細胞および単一核RNA-seqの実験法を確立し、これらの方法が中胚葉への分化過程にある一過的な細胞状態を検出できるほど高感度であることや、胚盤の前後軸に沿った極性を再構成できることを明らかにした。さらに、核を用いた解析は細胞を用いた解析よりも遺伝子発現の検出が高感度に行え、縞パターン形成時に現われる新たな細胞状態を捉えることが可能であることが分かった。今年度は、まず、これらの胚盤期での結果を論文として発表した。続いて、縞パターンが形成される胚帯期の胚を用いた実験を進めた。in situハイブリダイゼーションによる染色結果との比較のために単一細胞RNA-seqによる解析を行うことを考え、実験開始時に困難であった細胞の解離の条件を検討し、タンパク質分解酵素を使用する方法を確立した。しかし、細胞の回収効率などに問題があったため、胚帯期の胚の解析も単一核RNA-seqにより行うこととした。単一核RNA-seqのライブラリーを作製し、データの取得を行い、Seuratによる解析を行った。クラスタリングの結果、この発生段階でも三胚葉が検出でき、さらに中胚葉細胞の体の前後の違いが検出されたことが分かった。外胚葉細胞の集団には前後のパターンとともに、体節の縞パターンも再構築された。この再構築されたパターンの解析を進めている。

在这项研究中，我们旨在使用ROE-SEA胚胎分析单细胞RNA-seq，并在条纹模式形成过程中了解单细胞水平的基因表达，这是体征形成的基础。到去年，我们使用胚药中的胚胎建立了用于单细胞和单核RNA-seq的实验方法，在胚中积累了基因表达信息，并揭示了这些方法非常敏感，足以检测到中胚层中分化的瞬时细胞状态，以及沿孔胚层的极性轴心轴的极性可以重新构建。此外，发现使用核的分析比使用细胞分析更敏感地检测基因表达，并且在形成条纹模式时出现的新细胞状态出现。今年，我们首先发表了这些杂物阶段的结果。接下来，在形成条纹图案的胚带阶段使用胚胎进行实验。考虑到使用单细胞RNA-Seq进行分析以将结果与原位杂交染色进行比较，我们研究了在实验开始时很难进行细胞解离的条件，并使用蛋白水解酶建立了一种方法。但是，由于细胞恢复效率的问题，还使用单个核RNA-Seq进行了胚胎带期间胚胎的分析。准备了一个核RNA-Seq库，获取数据，并使用Seurat进行了分析。聚类表明，即使在此发育阶段也可以检测到触发物，并且检测到中胚层细胞体之间的差异。外胚层细胞种群还通过室内的前后模式重建。我们目前正在分析这种重建模式。