肝疾患治療用細胞シートの液性因子に着目した新規肝硬変治療法の開発

开发针对肝病治疗的细胞片层体液因子的肝硬化新治疗方法

基本信息

批准号：
20K08331
负责人：
板場則子
金额：
$ 2.75万
依托单位：
Tottori University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2020
资助国家：
日本
起止时间：
2020-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-20K08331/
关键词：
肝硬変セクレトーム MSC 線維症エクソソーム肝線維化間葉系幹細胞

项目摘要

温度応答性培養皿上で間葉系幹細胞(MSC)にWnt/β-catenin経路阻害剤IC-2を添加し作製する肝疾患治療用細胞シートは、マウス肝表面へ移植した際に、IC-2未処理のMSCシートよりも強い線維化抑制効果を示す。この線維化抑制効果は、移植肝葉とは別の肝葉でも認められることから、細胞シートより産生される液性因子が肝線維化抑制効果に重要と考えられる。本研究では、肝線維化抑制作用を示す因子を同定し、その肝線維化抑制効果を肝硬変モデルマウスで検証し、Proof of Concept (POC)を確立することを目的とする。IC-2処理MSCの濃縮培養上清からなるセクレトームを限外ろ過フィルターにより分画すると、約10－30kDaの分画が肝星細胞活性化抑制効果を示す。該当分画をさらにゲルろ過クロマトグラフィーにて50分画と細分画化し、肝星細胞活性化抑制効果を示す分画に含まれるタンパクを質量分析により解析したところ、上位20タンパクの中には、すでに線維分解酵素として知られているマトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)-1が含まれていた。しかし、MMP-1のリコンビナントタンパクは肝星細胞の活性化を抑制しなかったことから、MMP-1以外のタンパクが肝星細胞活性化抑制効果を示すと推察される。一方、ラット腎線維芽細胞の上皮間葉転換(EMT)による腎線維症モデルのin vitro評価系では、約50－100kDaの分画がαSMAの発現抑制作用を示す。肝線維化抑制候補因子同様、ゲルろ過クロマトグラフィーにて50分画と細分画化し、腎線維化抑制作用を示す分画を選出した。質量分析を実施し、腎線維化抑制の本態となる分子の抽出を進める予定である。

通过将Wnt/β-catenin途径抑制剂IC-2添加到间充质干细胞（MSC）上，用于治疗肝脏疾病的细胞表，这些细胞表是在温度应对性培养培养皿上的抑制剂IC-2，比植入小鼠肝脏表面的MSC表面表现出比抑制纤维化的更强作用。除移植肝叶的肝叶外，还观察到这种纤维化的抑制作用，因此细胞表产生的体液因子对肝纤维化的抑制作用很重要。这项研究旨在确定表现出肝纤维化抑制作用的因素，验证其在肝硬化模型小鼠中对肝纤维化的抑制作用，并建立概念证明（POC）。当由IC-2处理的MSC的浓缩培养上清液组成的分泌组通过超滤过滤器分离时，大约10-30 kDa的比例显示出抑制肝星状细胞激活的作用。通过质谱法分析了相应的部分通过凝胶过滤色谱法进一步亚分数，并通过质谱法分析了表现出抑制肝星状细胞活化作用的馏分中包含的蛋白质。在前20个蛋白质中，发现基质金属蛋白酶（MMP）-1（已经被称为纤维蛋白溶液酶）是基质金属蛋白酶（MMP）-1。但是，由于MMP-1的重组蛋白没有抑制肝星状细胞的激活，因此据估计，MMP-1以外的其他蛋白质表现出抑制肝星状细胞激活的作用。另一方面，在大鼠肾成纤维细胞中上皮 - 间质转变（EMT）引起的肾纤维化模型的体外评估系统中，大约50-100 kDa的一部分表现出αSMA表达的抑制作用。像抑制肝纤维化的候选因子一样，通过凝胶过滤色谱法将馏分在50个部分中亚分数亚分分，并选择了表现出肾纤维化抑制作用的馏分。计划进行质谱法以提取抑制肾纤维化必不可少的分子。