膵癌organoidを用いた進行度特異的な遺伝子解析および診断マーカーの探索研究

本研究は、超音波内視鏡ガイド下穿刺生検（EUS-FNA）検体由来の膵癌organoidを用いて遺伝子解析を行い、膵癌進行度に特異的な遺伝子変異を呈するのか、また得られた膵癌細胞と膵間葉系細胞との共培養によりorganoidを構築し、培地から回収したEV由来のmiRNAの発現に影響を与えるかを目的としている。EUS-FNA検体から膵癌organoidの樹立は安定的に行う事が可能であるが、検体採取量にも依存するため、樹立効率は68%であった。樹立した18検体の膵癌organoidと膵切除検体から樹立した正常膵管上皮organoid2検体の中から、正常膵管上皮organoid1検体と、膵癌organoid3検体を選択肢、初代培養と10継代培養したorganoid間で遺伝子変異が維持されるかを確認するために、comprehensive cancer panelで代表的な癌遺伝子について変異解析を行った。膵癌organoid3検体については、継代を経てもKRAS変異および他の癌遺伝子変異を安定的に保持する事が確認され、正常膵管上皮organoidでは膵癌に特徴的に発現する癌遺伝子変異を認めない事を確認した。organoid培地から回収した培地から超遠心機で既報のプロトコールと同様に遠心し、EVを回収した。NanoSightでEVの大きさと数の評価を行い、平均して1.0×1E6/ml個が2mlの培地から得られた。RNeasy Midi kit (QIAGEN)を用いて培地からexsosomal RNAを抽出し、Bioanalyser (Agilent)でsmall RNAの質的評価を行い、1.8-5.0 ng/ulのsmall RNAが抽出可能であった。

本研究は、超音波内視鏡ガイド下穿刺生検（EUS-FNA）検体由来の膵癌organoidを用いて遺伝子解析を行い、膵癌進行度に特異的な遺伝子変異を呈するのか、また得られた膵癌細胞と膵間葉系細胞との共培養によりorganoidを構築し、培地から回収したEV由来のmiRNAの発現に影響を与えるかを目的としている。EUS-FNA検体から膵癌organoidの樹立は安定的に行う事が可能であるが、検体採取量にも依存するため、樹立効率は68%であった。樹立した18検体の膵癌organoidと膵切除検体から樹立した正常膵管上皮organoid2検体の中から、正常膵管上皮organoid1検体と、膵癌organoid3検体を選択肢、初代培養と10継代培養したorganoid間で遺伝子変異が維持されるかを確認するために、comprehensive cancer panelで代表的な癌遺伝子について変異解析を行った。膵癌organoid3検体については、継代を経てもKRAS変異および他の癌遺伝子変異を安定的に保持する事が確認され、正常膵管上皮organoidでは膵癌に特徴的に発現する癌遺伝子変異を認めない事を確認した。organoid培地から回収した培地から超遠心機で既報のプロトコールと同様に遠心し、EVを回収した。NanoSightでEVの大きさと数の評価を行い、平均して1.0×1E6/ml個が2mlの培地から得られた。RNeasy Midi kit (QIAGEN)を用いて培地からexsosomal RNAを抽出し、Bioanalyser (Agilent)でsmall RNAの質的評価を行い、1.8-5.0 ng/ulのsmall RNAが抽出可能であった。