傷害糸球体のポドサイトに作用する血小板分子CLEC-2の効果

血小板分子CLEC-2对损伤肾小球足细胞的影响

基本信息

批准号：
20K17257
负责人：
田中景子
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Okayama University (2021-2022)Tokai University (2020)
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
财政年份：
2020
资助国家：
日本
起止时间：
2020-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-20K17257/
关键词：
ポドサイト血小板 Podoplanin CLEC-2 腎臓

项目摘要

Podoplaninは腎糸球体ポドサイトの細胞膜に強く発現するが、その機能は不明である。Podoplaninの内因性結合分子は、血小板に発現するC-type lectin likereceptor-2（CLEC-2）である。正常時、ポドサイトは糸球体基底膜により血小板から隔絶されているが、基底膜傷害時に血小板や血漿中の可溶性CLEC-2がポドサイトに作用する事が考えられた。リコンビナントCLEC-2を作製し、in vitroおよびin vivo実験を行った。in vitro実験では、FcおよびFc-CLEC-2で培養ポドサイトを刺激する実験を行った。Fcコントロールに比較し、Fc-CLEC-2刺激では、ポドサイトのアクチン線維が減少し、細胞突起は収縮し、細胞接着能の低下と遊走能の向上をみとめた。また、Podoplaninとアクチン線維をつなぐ介在蛋白ERMの脱リン酸化をみとめた。in vivo実験のために、より小分子のStrepTagII-FLAGタグCLEC-2（約30kDa）の発現Vectorを作製し大量精製した。正常マウスに投与したところ、FLAG-CLEC-2の糸球体への接着を確認でき、糸球体のRNA解析でSerpine1の上昇をみとめ、電顕像でポドサイトの足突起の退縮をみとめた。糸球体LysateのWestern Blotと蛍光染色では、Ezrinの脱リン酸化をみとめた。以上より、血小板分子CLEC-2は、糸球体傷害時にポドサイトに発現するPodoplaninに結合し、介在蛋白Ezrinの脱リン酸化により、 Podoplaninからアクチンを乖離させ、アクチン線維の収縮を起こし、その結果ポドサイトは形態変化をおこし、遊走能を獲得することが明らかになった。

Podoplanin在肾小球足细胞的细胞膜中强烈表达，但其功能尚不清楚。 Podoplanin的内源性结合分子是在血小板上表达的C型凝集素LikeRepector-2（CLEC-2）。通常，肾小球基底膜从血小板中分离出足细胞，但人们认为血小板中的可溶性CLEC-2和血浆可以在基底膜损伤期间对足细胞作用。准备重组CLEC-2，并进行体外和体内实验。在体外实验中，进行了实验以刺激FC和FC-CLEC-2刺激培养的足细胞。与FC对照相比，FC-CLEC-2刺激降低了足细胞的肌动蛋白纤维并收缩了细胞的突起，从而降低了细胞粘附和提高的迁移能力。我们还观察到将podoplanin与肌动蛋白纤维连接起来的介导蛋白ERM的去磷酸化。对于体内实验，产生了较小的分子链球菌II-FLAG TAG CLEC-2（约30 kDa）的表达向量并进行了质量纯化。当对正常小鼠施用时，确认了FLAG-CLEC-2对肾小球的粘附，并通过肾小球RNA分析观察到serpine1的升高，并且通过电子显微镜观察到足部足细胞的脚步过程。在Western印迹和肾小球裂解物的荧光染色中观察到Ezrin的去磷酸化。从上面可以看出，血小板分子clec-2与阶梯蛋白结合，在肾小球损伤过程中以五核表示，介导的蛋白Ezrin的去磷酸化导致podopplanin引起脱磷蛋白的脱磷蛋白，从而导致Actin fibers actin fibers的迁移，从而导致podsoditient and Morphosic and Morphosic and Morphosic and Merfodsodic and Morphosic and Podiration。