好酸球性多発血管炎性肉芽腫症における2型自然リンパ球の機能解析

嗜酸性肉芽肿性多血管炎2型先天淋巴细胞功能分析

• 批准号: 20K17437
• 负责人: 町山 智章
• 金额: $ 2.58万
• 依托单位: Tohoku University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• 财政年份: 2020
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2020-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-20K17437/
• 关键词: EGPA; 好酸球; ILC2; 免疫沈降法; ANCA; 自然リンパ球; IL-33; 好酸球性多発血管炎性肉芽腫症; 血管炎; 2型自然リンパ球; アレルギー

健常者の末梢血検体を用いて予備実験を行った。末梢血単核球（PBMCs）を分離し、マルチカラーフローサイトメトリーを用いて各種免疫細胞(ILC2, T細胞, B細胞, 好酸球, 好中球,樹状細胞)の発現頻度を解析した。先行文献に倣い、ヒトILC2s はLineage- CD45+ IL-7Ra+ CRTH2+と定義した。しかしながら、EGPA患者では健常者と比較してILC2は増加しているものの絶対数は非常に少なく、一般的な表面抗原解析やソーティング後のRNA抽出は困難と判断した。そこで、現在は主に好酸球に焦点を当てた解析を行っている。EGPA患者ではIL-33やTSLP,IL-25などのAlarminと呼ばれる血清サイトカイン濃度が有意に増加しており、これらのサイトカイン刺激による好酸球の機能や活性の変化を評価した。ANCA関連血管炎の病理像ではしばしば小血管の壊死性血管炎を呈することから、好酸球上に内因性リガンドや死細胞を認識する分子の発現が誘導されているのではないかという仮説を立てた。末梢血から分離した好酸球をin vitroにてIL-33で刺激を行い、mRNA発現およびフローサイトメトリーによる表面抗原の発現を評価した。IL-33刺激に伴い一部のTLR発現増加は認められたが、死細胞センサーであるMincleはタンパク質レベルでは有意な発現の増加は認めなかった。EGPAはANCA陽性例と陰性例では臨床像が異なり、近年ではそれぞれで遺伝的背景が異なることも報告されている。ANCA陰性のEGPA患者では未知の自己抗原が存在する可能性があると仮説を立て、現在は主に患者血清を用いた免疫沈降法の実験系の確立を目指している。

使用来自健康个体的外周血标本进行初步实验。分离外周血单核细胞（PBMC），并使用多色流式细胞仪分析了各种免疫细胞（ILC2，T细胞，B细胞，嗜酸性粒细胞，嗜中性粒细胞，嗜中性粒细胞，树突状细胞）的表达频率。遵循先前的文献，人类ILC2S被定义为谱系-CD45+ IL-7RA+ CRTH2+。但是，尽管与健康个体相比，EGPA患者的ILC2增加了，但绝对数量非常小，并且认为排序后的一般表面抗原分析和RNA提取被认为很困难。因此，我们目前正在进行主要关注嗜酸性粒细胞的分析。 EGPA患者的血清细胞因子浓度（例如IL-33，TSLP和IL-25）称为Alarmin浓度显着增加，我们评估了由细胞因子刺激引起的嗜酸性粒细胞功能和活性的变化。由于与ANCA相关的血管炎的病理图像经常出现小血管的坏死性血管炎，因此我们假设诱发了识别嗜酸性粒细胞上死细胞的内源性配体和分子的表达。用在体外IL-33刺激从外周血分离的嗜酸性粒细胞，以评估通过流式细胞仪评估mRNA表达和表面抗原表达。尽管通过IL-33刺激增加了某些TLR表达，但死细胞传感器Mincle在蛋白质水平上的表达并未显着增加。 EGPA在ANCA阳性病例和阴性病例之间具有不同的临床情况，近年来，据报道，每种病例的遗传背景都是不同的。我们假设ANCA阴性EGPA患者可能存在未知的自身抗原，目前旨在建立一种主要使用患者血清的实验系统进行免疫沉淀系统。