Bioengineering of functional bladder substitute using tissue decellularization and autologous derived bladder cells

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われわれは、二分脊椎・神経因性膀胱・外傷・腫瘍等が原因で進行した膀胱機能不全に対する再生治療として、異種由来組織と自己由来細胞を組み合わせた生体適合性の高い再生膀胱組織の開発を目指している。具体的には、異種組織由来細胞外マトリックスに自己由来膀胱細胞を播種することで、組織を三次元的に再構築し、人体へ移植可能な人工膀胱組織片を作成することを目標としている。これまで、細胞外マトリックスの作成、ヒト尿路上皮細胞の培養、両者を組み合わせて三次元膀胱組織を作成するプロトコールの確立を行なった。本年度は、機能的な三次元膀胱組織作成のためのプロトコールの最適化、および作成した膀胱組織の生理学的評価を行なった。1. 細胞外マトリックス上播種培養における細胞培養密度の最適化：ヒト由来尿路上皮細胞を既定培地（Keratinocyte serum free medium)で培養、増殖させた。マトリックス上播種に際して、複数の細胞培養密度を検討した結果、1 x 10^6 cells/cm2を選択した。2. 細胞外マトリックス上播種培養における細胞分化誘導法の最適化：複数の細胞播種プロトコールを比較した結果、尿路上皮細胞増殖期にてマトリックス上に播種し、接着培養ののち、マトリックス上で分化誘導を行う方法が最も良好な細胞生存を認めることが判明した。分化誘導法としては、前述の培地にウシ血清を加え培養し、さらに培養液中カルシウムイオン濃度を上昇させる方法を選択した。3. 細胞外マトリックス上播種培養後の細胞成熟の評価：作成した三次元組織の組織成熟度を評価するため、ヘマトキシリンエオジン染色、および免疫染色を行なった。組織内腔には多層から構成される膀胱上皮が再生し、組織成熟が示唆された。また、免疫染色において、三次元組織内の上皮層が、生体の膀胱組織と類似した組織構築を示した。