hiPS細胞シングルセル蛍光イメージングによる眼発生初期のRAX遺伝子の機能解明

利用 hiPS 细胞的单细胞荧光成像阐明早期眼发育过程中 RAX 基因的功能

• 批准号: 20K18380
• 负责人: 小林 礼子
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• 财政年份: 2020
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2020-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-20K18380/
• 关键词: ヒトiPS細胞の遺伝子組み換え; シングルセル蛍光イメージング; ヒトiPS細胞; 眼発生

ヒトiPS細胞で眼の発生を模倣するSEAM法を基盤技術として、眼の発生初期に発現する転写因子RAX遺伝子の生理学的な機能を詳細に解明するために研究を行っている。具体的には、RAX発現細胞を可視化してその細胞の挙動を追跡できるようなイメージングシステムの樹立、RAX遺伝子ノックアウト細胞の樹立、そしてそれらの細胞を用いて、RAX発現細胞と関連する眼発生ネットワークの解析を行うことを目標としている。これまでにCRISPR/Casシステムを用いて、RAX遺伝子の発現に伴い蛍光蛋白質を発現する遺伝子組み換えヒトiPS細胞の樹立を試みていた。昨年度までのコンストラクトでは遺伝子組み換えを起こすことができなかったため、今年度はコンストラクトを変更し、新たな組み換え用ベクターとCas gRNAベクターを作製した。作製したベクターをヒトiPS細胞にトランスフェクションし、薬剤選択を行い、生き残った細胞のうち、蛍光蛋白質の発現しているクローンを複数取得した。得られたクローンのgenotypingを行ったところ、目的の遺伝子の場所に遺伝子導入できていることが確認できた。現在genotypingが終わっているクローンでは、遺伝子導入がホモあるいはヘテロで起こったことが確認できている。今後はこれらのクローンを用いて、実験を進めていく予定である。また、今回遺伝子組み換えを行った際に、RAX遺伝子がノックアウトされた細胞も得られた可能性があるので、それを単離する予定としている。

基于模仿人IPS细胞眼睛发育的接缝方法，我们正在进行研究，以详细阐明转录因子rax基因的生理功能，该基因在眼睛发育的早期阶段表达。具体而言，目的是建立一个允许可视化RAX表达RAX的细胞并跟踪细胞行为，建立RAX基因基因敲除细胞的成像系统，并使用这些细胞分析与表达RAX表达细胞相关的眼睛开发网络。到目前为止，我们一直试图建立通过CRISPR/CAS系统结合使用RAX基因的表达荧光蛋白的转基因的人IPS细胞。由于无法直到去年进行转基因的结构，因此今年我们更改了创建新的重组向量和CAS GRNA矢量的结构。将制备的载体转染到人IPS细胞中，并进行药物选择，在存活的细胞中，获得了表达荧光蛋白的多个克隆。当获得的克隆是基因分型的时，可以证实基因转移可以转移到所需基因的位置。已经证实，基因转移发生在目前经过基因分型的克隆中。将来，我们计划继续使用这些克隆进行实验。此外，当还获得了这次基因修饰后，将RAX基因撞倒的细胞可能会敲定，因此他们计划隔离它们。