hiPS細胞シングルセル蛍光イメージングによる眼発生初期のRAX遺伝子の機能解明

利用 hiPS 细胞的单细胞荧光成像阐明早期眼发育过程中 RAX 基因的功能

• 批准号: 20K18380
• 负责人: 小林 礼子
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• 财政年份: 2020
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2020-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-20K18380/
• 关键词: ヒトiPS細胞の遺伝子組み換え; シングルセル蛍光イメージング; ヒトiPS細胞; 眼発生

ヒトiPS細胞で眼の発生を模倣するSEAM法を基盤技術として、眼の発生初期に発現する転写因子RAX遺伝子の生理学的な機能を詳細に解明するために研究を行っている。具体的には、RAX発現細胞を可視化してその細胞の挙動を追跡できるようなイメージングシステムの樹立、RAX遺伝子ノックアウト細胞の樹立、そしてそれらの細胞を用いて、RAX発現細胞と関連する眼発生ネットワークの解析を行うことを目標としている。これまでにCRISPR/Casシステムを用いて、RAX遺伝子の発現に伴い蛍光蛋白質を発現する遺伝子組み換えヒトiPS細胞の樹立を試みていた。昨年度までのコンストラクトでは遺伝子組み換えを起こすことができなかったため、今年度はコンストラクトを変更し、新たな組み換え用ベクターとCas gRNAベクターを作製した。作製したベクターをヒトiPS細胞にトランスフェクションし、薬剤選択を行い、生き残った細胞のうち、蛍光蛋白質の発現しているクローンを複数取得した。得られたクローンのgenotypingを行ったところ、目的の遺伝子の場所に遺伝子導入できていることが確認できた。現在genotypingが終わっているクローンでは、遺伝子導入がホモあるいはヘテロで起こったことが確認できている。今後はこれらのクローンを用いて、実験を進めていく予定である。また、今回遺伝子組み換えを行った際に、RAX遺伝子がノックアウトされた細胞も得られた可能性があるので、それを単離する予定としている。

ヒ ト iPS cells で eye の 発 raw を imitate す る を SEAM method base plate technology と し て, eye の 発 born early に 発 now す る planning write factor RAX heritage 伝 son の physiology な function を detailed に interpret す る た め に を line っ て い る. Specific に は, RAX 発 now cells を visualization し て そ の cells の 挙 dynamic を tracing で き る よ う な イ メ ー ジ ン グ シ ス テ ム の set, traces of RAX 伝 son ノ ッ ク ア ウ ト cells の set, そ し て そ れ ら の cells を using い て, RAX 発 now cells と masato even す る eye 発 raw ネ ッ ト ワ ー ク の parsing line を う こ と を target と し て い る. こ れ ま で に CRISPR/Cas シ ス テ ム を with い て, traces of RAX 伝 son の 発 に now with い 蛍 light protein を 発 now す る heritage 伝 subgroups み in え ヒ ト iPS cells の set を try み て い た. Yesterday's annual ま で の コ ン ス ト ラ ク ト で は heritage 伝 subgroups み in え を up こ す こ と が で き な か っ た た め, our は コ ン ス ト ラ ク ト を - more し, new た み な group in え with ベ ク タ ー と Cas gRNA ベ ク タ ー を cropping し た. Cropping し た ベ ク タ ー を ヒ ト iPS cells に ト ラ ン ス フ ェ ク シ ョ ン し, 薬 tonic sentaku を い, raw き residual っ た cells の う ち, 蛍 light protein の 発 now し て い る ク ロ ー ン を plural obtain し た. Have ら れ た ク ロ ー ン の genotyping を line っ た と こ ろ, purpose の heritage 伝 child に の places but 伝 import で き て い る こ と が confirm で き た. Now genotyping が eventually わ っ て い る ク ロ ー ン で は, but 伝 import が ホ モ あ る い は ヘ テ ロ で up こ っ た こ と が confirm で き て い る. In the future, <s:1> く れら, <s:1> ロ, ロ, を and を will be determined by using れら て and experimental を to めて, く and く. ま た, today back to heritage 伝 subgroups み in え を line っ た interstate に, traces of RAX 伝 son が ノ ッ ク ア ウ ト さ れ も た cells have ら れ た possibility が あ る の で, そ れ を 単 from す る designated と し て い る.