疲弊化Ｔ細胞のシングルセルオミックス解析とリプグラミングによるＴ細胞疲弊の克服

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2020年度はまずT細胞のセルラインならびに、プライマリーＴ細胞を用いて、電気穿孔法を用いて遺伝子導入、また任意の部位を人工ヌクレアーゼであるTALENを用いて切断する実験系を構築した。複数遺伝子の改変・導入にむけ、複数の遺伝子を1回の遺伝子導入にて改変する技術、またシークエンシャルに2回にわけて遺伝子導入を行う方法を確立した。これらの技術の確立よりプライマリーT細胞の複数遺伝子を改変することが可能となり、非常に大きな技術面での進歩であった。2021年度は、その技術の臨床応用に向け、① 実際に治療用細胞をラージスケールにて作成する技術の確立、並びに②理論的に生じうるTALENによる遺伝子変異が生じないことを確認する実験系の確立、を目指した。前者①に関しては、試薬や遺伝子導入法（電気穿孔法）の条件検討を行い、プライマリーT細胞から実際の患者の治療に必要な細胞数の治療用T細胞製剤を作成する技術を確立できた。後者②であるが、実際の患者に投与するには、投与した治療用の細胞製剤が安全であることが必須であり、患者に投与する前に前臨床検査としての遺伝子変異検査が必要となる。遺伝子変異には、大きく塩基置換やInsertion-Deletionなどの配列変異と染色体構造変異（染色体転座や逆位など）があり、それぞれ別の検出系が必要となるため、それぞれの遺伝子変異検出系の確立を目指した。遺伝子配列変異に関しては、次世代シーケンサを用いてシングルセルレベルで検出する実験系を確立した。また染色体の構造変異に関しては、デジタルPCRを用いて10^-4オーダにて検出する実験系を確立することが可能となった。これらにより、我々の確立したがん治療用T細胞製剤の臨床応用に必要な細胞製剤の作成技術並びに安全管理上の必須な技術を確立し、実臨床への導入に大きく近づく成果が得られた。