心筋ミオシンII構造変化に基づく肥大型心筋症の病態発症機序の解明

基于心肌肌球蛋白II结构变化阐明肥厚型心肌病病理机制

• 批准号: 20K22922
• 负责人: 神窪 謙太
• 金额: $ 1.83万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Research Activity Start-up
• 财政年份: 2020
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2020-09-11 至 2021-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-20K22922/
• 关键词: 肥大型心筋症; サルコメア; ミオシン; ミオシン調節軽鎖

遺伝性肥大型心筋症(HCM)では、過剰収縮性を獲得する変異(hyper-contractile変異)のみでなく、収縮性が低下する変異(hypo-contractile変異)の相反する表現系が存在する。特にミオシン重鎖(MHC-β)の変異ではhyper-contractile変異が多く、ミオシン調節軽鎖(MLC2)の変異ではhypo-contractile変異の報告が多い。本研究では、これらの変異に基づくミオシン分子の構造(SRX/DRX)や収縮性、エネルギー消費の変化を同時に観察するため、種々の実験系構築に着手した。まず、本研究を遂行する上で必須となる、HCM変異をノックインしたiPS細胞由来心筋細胞株の作製を試みた。CRISPR-Cas9システムを用いることで、MHC-β変異(R403Q, F764L)及びMLC2変異(R403Q, R58Q)を導入した細胞株を樹立した。次に、ミオシン分子におけるSRX/DRXの存在比率を捉えるため、蛍光標識ヌクレオチドであるMant-ATPを心筋細胞に導入し、タイムラプスイメージングによってリアルタイムでの評価を可能とした。最後に、心筋細胞の収縮性を定量的に評価するため、高速撮影機能を備えたセルモーションイメージングシステムSI8000を用いて、発生張力と相関する細胞変形距離を測定するシステムと、直接的に培養心筋細胞の発生張力を測定できるcell force assayの2つの収縮測定系を確立した。今後は、変異導入したiPS細胞由来心筋細胞を用いることで、同時に確立してきた収縮・代謝系により機能評価を進める予定である。

hyper-contractile variation, hyper-contractile variation, hypo-contractile variation, and the opposite of hyper-contractile variation exist in HCM. The variation of MHC-β is reported as hyper-contractile variation, and the variation of MLC2 is reported as hypo-contractile variation. This study is aimed at investigating the molecular structure of SRX/DRX, and the relationship between SRX/DRX and DRX. In order to carry out this study, HCM cells were used to prepare iPS cells from muscle cells. CRISPR-Cas9 gene expression system was introduced into cell lines with MHC-β mutants (R403Q, F764L) and MLC-2 mutants (R403Q, R58Q). The presence ratio of SRX/DRX in the secondary and tertiary molecules is determined by the presence ratio of SRX/DRX. Finally, the quantitative evaluation of contraction of cardiac muscle cells, the use of high-speed imaging function, the measurement of cell deformation distance, the direct measurement of cell tension in cultured cardiac muscle cells, and the establishment of a contraction measurement system. In the future, iPS cells will be introduced from the heart muscle cells, and at the same time, they will be established.