Development of a system to analyze the intracellular dynamics of TLR4 for the discovery of novel vaccine adjuvants

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本年度はまず、マウス骨髄由来細胞を単離し、BMDCおよびBMDMに分化させ、それぞれが解析利用に足るものであることを、フローサイトメトリーおよび形態学的に確認した。またこの免疫系細胞にLPSで刺激を行ったところ、マウスマクロファージ様細胞株RAW264.7を比較して、数倍のサイトカイン分泌能を示したことから、リガンド構造のわずかな違いによるサイトカイン放出能の評価を行うのに適している細胞であることを確認した。　但しRAW264.7も簡便に利用できることから引き続きこの細胞も用いて検討を行う。続いて、フローサイトメトリーを用いてTLR4/MD2の細胞内移行の評価系を構築した。抗体には、LPSの結合の有無にかかわらず全てのTLR4を認識するSa15-21、および活性化(リガンド結合し二量体化する）前の単量体TLR4を認識するMTS510を用いた。リガンドには、昨年から引き続きEcLPSおよびRsLPSを用いた他、本研究においてスフィンゴミエリンがその脂肪酸鎖の長さの違いにより活性化能を調節できることが判明したので、これを用いて検討した。その結果、EcLPSおよびRsLPSについては予想通りのTLR4二量体化と内在化の解析結果が得られ、スフィンゴミエリンも同様に、濃度依存的、LPSとの共存によるアゴニスト・アンタゴニスト活性を評価することができた。スフィンゴミエリンについては、HEK-Blue TLR4細胞を用いたSEAPアッセイによるNF-kB活性評価、ならびにIL-6、IL1-βなどの各種サイトカイン放出能のELISAによる評価とほぼ傾向が一致した。