Development of a system to analyze the intracellular dynamics of TLR4 for the discovery of novel vaccine adjuvants

开发分析 TLR4 细胞内动态的系统，以发现新型疫苗佐剂

• 批准号: 21H02080
• 负责人: 樺山 一哉
• 金额: $ 10.82万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21H02080/
• 关键词: 自然免疫; サイトカイン解析; イメージング; フローサイトメトリー; ライブセルイメージング; TLR4; リポポリサッカライド; スフィンゴミエリン; 生細胞イメージング; リピドA; 細胞イメージング; 糖脂質; LPS

本年度はまず、マウス骨髄由来細胞を単離し、BMDCおよびBMDMに分化させ、それぞれが解析利用に足るものであることを、フローサイトメトリーおよび形態学的に確認した。またこの免疫系細胞にLPSで刺激を行ったところ、マウスマクロファージ様細胞株RAW264.7を比較して、数倍のサイトカイン分泌能を示したことから、リガンド構造のわずかな違いによるサイトカイン放出能の評価を行うのに適している細胞であることを確認した。　但しRAW264.7も簡便に利用できることから引き続きこの細胞も用いて検討を行う。続いて、フローサイトメトリーを用いてTLR4/MD2の細胞内移行の評価系を構築した。抗体には、LPSの結合の有無にかかわらず全てのTLR4を認識するSa15-21、および活性化(リガンド結合し二量体化する）前の単量体TLR4を認識するMTS510を用いた。リガンドには、昨年から引き続きEcLPSおよびRsLPSを用いた他、本研究においてスフィンゴミエリンがその脂肪酸鎖の長さの違いにより活性化能を調節できることが判明したので、これを用いて検討した。その結果、EcLPSおよびRsLPSについては予想通りのTLR4二量体化と内在化の解析結果が得られ、スフィンゴミエリンも同様に、濃度依存的、LPSとの共存によるアゴニスト・アンタゴニスト活性を評価することができた。スフィンゴミエリンについては、HEK-Blue TLR4細胞を用いたSEAPアッセイによるNF-kB活性評価、ならびにIL-6、IL1-βなどの各種サイトカイン放出能のELISAによる評価とほぼ傾向が一致した。

This year, we have confirmed the isolation of cells derived from the bone marrow, the differentiation of BMDC and BMDM, and the availability of these cells for analysis and utilization, as well as the identification of functional media and morphology. The cell line RAW264.7 was confirmed to be able to secrete several times more LPS than normal cells. However, RAW264.7 is easy to use. The evaluation system of intracellular migration of TLR4/MD2 was constructed by using TLR4/MD2. The presence or absence of LPS binding by antibodies and TLR4 recognition by TMS510 was detected by SA15 -21 and TLR4 recognition by MTS510 before activation. In this study, we found that the activity of LPS and RsLPS was regulated by the activity of LPS and RsLPS. The analysis results of TLR4 quantification and internalization were obtained. The results showed that the TLR4 quantification and internalization were similar, concentration-dependent, LPS blue-shift and activity evaluation. The activity of NF-kB in HEK-Blue TLR4 cells was evaluated by ELISA, and the activity of IL-6 and IL-1-β in HEK-Blue TLR4 cells was evaluated by ELISA.

项目成果

TLR4リガンドの機能評価 ～レポーターアッセイとイメージングによる解析～

TLR4配体的功能评价〜利用报告基因测定和成像进行分析〜

• 发表时间: 2021
• 作者: 大垣 仁之; 樺山 一哉; 内藤 ひかり; 下山 敦史; 狩野 裕考; 井ノ口 仁一; 深瀬 浩一
• 通讯作者: 深瀬 浩一

難治性がん治療のためのα線核種標識抗体の創製および機能評価

用于治疗顽固性癌症的α核素标记抗体的创建和功能评估

• 发表时间: 2021
• 作者: Raj Kishan Agrahari;榎本 拓央;伊藤 弘樹;中野 友貴;柳瀬 笑子;渡部 敏裕;井内 聖;小林 正智;山本 義治;小山 博之;小林 佑理子;樺山一哉
• 通讯作者: 樺山一哉

蛍光標識化糖脂質プローブを用いた細胞膜糖脂質の動態解析

使用荧光标记糖脂探针动态分析细胞膜糖脂

• 发表时间: 2021
• 作者: 樺山一哉;新井健太;蟹江治;蟹江善美;深瀬浩一
• 通讯作者: 深瀬浩一

短寿命α線放出核種を用いた腫瘍特異的な免疫活性化機構の解明

利用短寿命α射线发射核素阐明肿瘤特异性免疫激活机制

• 发表时间: 2022
• 作者: 黛功樹;樺山一哉;黄栩昊;兼田加珠子;豊嶋厚史;深瀬浩一
• 通讯作者: 深瀬浩一

Quantitative analysis of galectin-dependent glycoprotein dynamics by using synthetic glycan displaying system on the cell surface

利用细胞表面合成聚糖展示系统定量分析半乳糖凝集素依赖性糖蛋白动力学

• 发表时间: 2021
• 作者: Atsushi Kimishima;Hiroki Kato;Keijin Nakaguro;Masayoshi Arai;Ayane Miura; Syuto Miyake; Kazuya Kabayama; Yoshiyuki Manabe; Asuka Shirakawa; Hiroki Syomura; Toshiyuki Yamaji; Kenichi Suzuki; Koichi Fukase
• 通讯作者: Ayane Miura; Syuto Miyake; Kazuya Kabayama; Yoshiyuki Manabe; Asuka Shirakawa; Hiroki Syomura; Toshiyuki Yamaji; Kenichi Suzuki; Koichi Fukase