Modulation of Membrane Protein Dynamics by Glycan-Galectin Interaction

聚糖-半乳糖凝集素相互作用调节膜蛋白动力学

• 批准号: 22K19112
• 负责人: 樺山 一哉
• 金额: $ 4.08万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-06-30 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K19112/
• 关键词: 糖鎖; ガレクチン; HaloTag; 膜タンパク質; 内在化; ライブセルイメージング; レクチン; 相互作用

本年度は、細胞外ドメインにHaloTagを融合した膜タンパク質を発現させるためのプラスミドを構築し、膜上での発現を確認した。現在、HaloTagを融合タンパク質の安定発現株の作製に手間取っており、再検討を実施中である。回避策として、このHaloTag発現細胞（一過性発現）に、蛍光プローブを導入した合成糖鎖を結合させたHaloTagリガンド(7糖、9糖、12糖)を添加し、合成糖鎖提示細胞を作製し評価に用いた。上記細胞に対して、ガレクチンを代表とする各種レクチンを作用させることで、糖鎖構造の異なる各HaloTag融合膜タンパク質がどのような挙動を示すか、共焦点走査型蛍光顕微鏡でイメージング解析を実施した。 解析手法には細胞内の輝点計測ならびにFRAP法、１粒子追尾法による側方拡散解析を行った。本研究で用いるHaloTagリガンドは糖鎖の数が増えるほどガレクチンへの結合能が向上することが知られており、これまでに側方拡散の制御を実証していた。今回、上記リガンドを結合させた膜タンパク質はガレクチンの存在下で、内在化にある程度の差が生じることが実証された。すなわち、ガレクチンと相互作用を示す合成糖鎖を導入した膜タンパク質の精密な内在化抑制を確認した。また、顕微鏡によるイメージング解析と併せて、フローサイトメトリーによる細胞膜タンパク質の発現量変化を測定した（一過性発現細胞株による先行的検証）。本検討は現在至適条件を確定中である。また、当研究室で合成された糖鎖結合HaloTag リガンドにはテトラメチルローダミンが導入されているため、今後フローサイトメトリーにおいてこの蛍光プローブを検出できるレーザーの導入も検討する。

This year, HaloTag fusion was confirmed on the extracellular membrane. Now, HaloTag fusion, quality and stability of the plant during the production of manual selection, re-examination and implementation. Avoidance strategy, HaloTag discovery cells (transient discovery), introduction of fluorescent light, incorporation of synthetic glycans into HaloTag discovery cells (7, 9, 12 sugars), addition of synthetic glycans, and evaluation of HaloTag discovery cells. Note that cell pairs, cell pairs The analytical method includes the FRAP method, the one-particle rear-end method, and the lateral dispersion analysis. In this study, the binding energy of HaloTag is used to increase the number of sugar chains, and the control of lateral dispersion is demonstrated. In this paper, the difference between the degree of internalization and the degree of internalization is recorded. The interaction between the two molecules shows that the sugar chain is introduced into the membrane and the precise internalization is suppressed. Microscopic analysis and measurement of the amount of cell membrane protein production (preliminary evidence of transient cell line production) This paper discusses the current conditions for determining the In addition, when the research laboratory synthesizes the sugar lock, the HaloTag is released, and the light lock is released.

项目成果

FRAP法を用いたフェンレチニドによる膜流動性変化の解析

使用 FRAP 方法分析芬维A胺引起的膜流动性变化

• 发表时间: 2022
• 作者: 黄栩昊;樺山一哉;林康宏;深瀬浩一
• 通讯作者: 深瀬浩一

合成糖鎖を生やした細胞で観る膜分子の動態

在具有合成糖链的细胞中观察到的膜分子动力学

• 发表时间: 2022
• 作者: 三浦彩音 ;樺山一哉 ;真鍋良幸;三宅秀斗;白川明日香;初村洋紀;山地俊之;鈴木健一;深瀬浩一
• 通讯作者: 深瀬浩一

合成生物学的アプローチによる細胞表層糖鎖ネットワークの解析

使用合成生物学方法分析细胞表面聚糖网络

• 发表时间: 2022
• 作者: Yutaro Uchida;Ryota Kurimoto;Tomoki Chiba;Yasuto Takeuchi;Noriko Gotoh;Hiroshi Asahara;真鍋良幸，三浦彩音，三宅秀斗，鈴木健一，樺山一哉，深瀬浩一
• 通讯作者: 真鍋良幸，三浦彩音，三宅秀斗，鈴木健一，樺山一哉，深瀬浩一