クチナーゼCut190のCa2+結合に伴う動的構造変化とPET分解分子機構の解明

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放線菌Saccharomonospora viridis AHK190由来のクチナーゼ（Cut190）の分子内にジスルフィド結合を導入した変異体（Cut190**SS）で、PET分解に必要なガラス転移温度（約70℃）以上の耐熱性を有し、実際にPET分解も認められた結果を踏まえ、Cut190**SS、及びさらにアミノ酸置換した変異体を用いて、研究を進めた。Cut190では、Ca2+存在下で活性化する特徴をもつが、Cut190**SSで、70℃以上での活性測定を行った結果、Ca2+非存在下でも、部分的に活性が認められた。この実験結果を踏まえて、分子動力学計算（MD）を用いた構造分布の温度依存性を解析したところ、25℃付近では、結晶構造でも認められた「open構造」と「closed構造」が別々に観測されたのに対して、70℃付近では、両構造が１つに融合した分布となった。これらの結果は、各構造間のエネルギー障壁が、高温下では相対的に低くなり、Ca2+依存的な構造変化の寄与が小さくなったと考えられる。さらにCa2+存在下、非存在下での、溶液中での動的構造が如何に変化するかを明らかにすべく、ジスルフィド結合導入前のCut190**を用いて、サイズ排除クロマトグラフィー付きX線小角散乱（SEC-SAXS）実験を行った。その結果、Ca2+添加に伴い、慣性半径Rgで0.2-0.3Åの減少が認められた。特にジスルフィド結合導入前では、Ca2+添加に伴い、熱安定性も大きく上昇することから、Ca2+結合に伴い、Cut190**分子内結合が強まり、Rgが減少したものと考えられる。