マグロの雌雄を決定する遺伝子およびその作用機序の解明

クロマグロの性決定遺伝子候補であるsult1st6yについて、そのリコンビナントタンパク質を作製するためにHisタグ付加発現ベクターを構築した。これを用いて大腸菌による発現誘導を試みたところ目的タンパク質が得られなかったため、GSTタグを用いた発現系について条件検討を行った。これらと並行してクロマグロ受精卵を用いたsult1st6yのノックアウト実験系を立ち上げた。具体的には、sult1st6yを特異的に切断するsingle-guide RNA (sgRNA)を設計するとともに、受精卵へのマイクロインジェクションによりsgRNA及びCas9タンパク質について処理条件を至適化した。また、クロマグロの生殖腺細胞を用いてシングルセルRNA-seqを実施するとともに、Assay for Transposase-Accessible Chromatin sequencing (ATAC-seq)によるオープンクロマチン領域の配列情報の収集を開始した。前年度に引き続いて、クロマグロ近縁魚種のsult1st6yおよびそのパラログであるsult1st6aの各エクソンを増幅するPCRプライマーを用いて、コシナガとビンナガにおいて各遺伝子のエクソン配列を決定した。また、マグロ属および他のサバ科魚類のゲノム配列を比較するとともに、sult1st6y/sult1st6aのホモログを用いた分子系統解析から、sult1st6yが出現した時期を推定することができた。

クロマグロの性決定遺伝子候補であるsult1st6yについて、そのリコンビナントタンパク質を作製するためにHisタグ付加発現ベクターを構築した。これを用いて大腸菌による発現誘導を試みたところ目的タンパク質が得られなかったため、GSTタグを用いた発現系について条件検討を行った。これらと並行してクロマグロ受精卵を用いたsult1st6yのノックアウト実験系を立ち上げた。具体的には、sult1st6yを特異的に切断するsingle-guide RNA (sgRNA)を設計するとともに、受精卵へのマイクロインジェクションによりsgRNA及びCas9タンパク質について処理条件を至適化した。また、クロマグロの生殖腺細胞を用いてシングルセルRNA-seqを実施するとともに、Assay for Transposase-Accessible Chromatin sequencing (ATAC-seq)によるオープンクロマチン領域の配列情報の収集を開始した。前年度に引き続いて、クロマグロ近縁魚種のsult1st6yおよびそのパラログであるsult1st6aの各エクソンを増幅するPCRプライマーを用いて、コシナガとビンナガにおいて各遺伝子のエクソン配列を決定した。また、マグロ属および他のサバ科魚類のゲノム配列を比較するとともに、sult1st6y/sult1st6aのホモログを用いた分子系統解析から、sult1st6yが出現した時期を推定することができた。