Development of cell-cycle-regulated CRISPR/Cas system

细胞周期调控的CRISPR/Cas系统的开发

• 批准号: 21H02469
• 负责人: 近藤 一成
• 金额: $ 11.15万
• 依托单位: Showa Women's University (2023)National Institute of Health Sciences (2021-2022)
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21H02469/
• 关键词: ゲノム編集; DNA修復; レポーター細胞; 細胞周期; DNA２本鎖切断; CRISPR

本研究課題では、医療分野や農業分野での安全な利用を目指して，細胞周期に応じて適切なゲノム編集活性を示す「細胞周期制御型CRISPR/Casシステム」を構築するために必要な基盤研究を行うものである.修復エラーが多い非相同末端結合修復を阻害し、細胞周期のS～G2/M期への同調が編集効率と精度向上に有効であると考えられているが ，細胞周期の変化が生物自身のゲノムや細胞機能に与える影響はこれまで全く検討されていない。ヒト細胞（RPE-1）を用いて、CRISPR/CasによりDNA2本鎖誘導の過程で起きる現象について、各細胞周期で誘導するすべての変異と遺伝子発現変化を解析することで，各細胞周期で最適な条件でゲノム編集を実行できるシステムの確立を行う.すなわち、細胞自身のDNA修復機能に手を加えず，最適な細胞周期条件でゲノム編集が実行されるシステム構築を行うものである.１年目は、DNA２本鎖切断後の欠失が生じた細胞を蛍光検出できる、レポーター細胞構築のためのベクターコンストラクトを、蛍光タンパク発現をTet-on制御下で出来るようにした上で、ヒトゲノムの異なる標的部位に挿入できるように設計した。ヒト２倍体ゲノムのそれぞれのアレルをEmerald, または、Scarletで検出するためのドナーベクター作製を行った。2年目は、RPE-1細胞へ設計したドナーベクターを遺伝子導入してクローン化により樹立を行った。TK1 locusおよびAAVSへの導入を行ったところ、TK1 locusにemeraldを持つコンストラクト1コピー導入された細胞を樹立することが出来た。樹立した細胞について、導入配列を確認後、tet-onの作動性、細胞機能の野生型との違いのないことを確認して、現在、CRISPR/Cas9でDNA2本鎖した細胞をFACS解析出来るようにアッセイ系を構築している。

This research project aims at safe utilization in both medical and agricultural fields, and demonstrates the appropriate activity of cell cycle control in the production of CRISPR/Cas. Repair of multiple non-identical terminal combinations of repair, cell cycle S~G2/M phase coherence, compilation efficiency, accuracy, cell cycle changes, biological needs, cell function, and effects. CRISPR/Cas is involved in the initiation of DNA2 gene lock induction in RPE-1 cells. The induction of different genes in each cell cycle is analyzed. The optimal conditions for the compilation of DNA 2 gene in each cell cycle are established. The DNA repair function of the cell itself should be enhanced, and the optimal cell cycle conditions should be set up to carry out the system construction. The DNA2 lock should be cut off, and the cells should be regenerated. The cell structure should be enhanced, and the light should be developed, and the Tet-on control should be enhanced. The design of the design is based on the different parts of the design. Emerald, Scarlet, etc. 2 years ago, RPE-1 cells were designed to be introduced into the genome. TK1 locus is introduced into the cell and the TK1 locus is emerald. After establishment of the cell, confirmation of the introduction sequence, confirmation of the activity of tet-on, wild-type and non-functional cell, and analysis of CRISPR/Cas9 DNA2 gene by FACS, construction of the cell line.

项目成果

Strategy for detecting off-target sites in genome-edited rice

• DOI: 10.1101/2021.05.28.446070
• 发表时间: 2021-05
• 期刊: bioRxiv
• 作者: Jumpei Narushima;Shinya Kimata;Yuh Shiwa;T. Gondo;Satoru Akimoto;K. Soga;Satoko Yoshiba;Kosuke Nakamura;N. Shibata;K. Kondo

国立医薬品食品衛生研究所 生化学部 ホームページ

国立健康科学研究所生物化学系主页

ヒト細胞TK6を用いたCRISPR/Casによる構造変異(SV)解析の検討

使用人类细胞 TK6 通过 CRISPR/Cas 进行结构变异 (SV) 分析的研究

• 发表时间: 2021
• 作者: 近藤一成;成島純平;曽我慶介;吉場聡子;柴田識人;坂田こずえ;田口千恵;加藤怜子
• 通讯作者: 加藤怜子

G2/M arrest and CDK1 inhibitor treatment significantly suppress genome-wide mutations and genomic rearrangements in genome-edited cells

G2/M 期停滞和 CDK1 抑制剂治疗可显着抑制基因组编辑细胞中的全基因组突变和基因组重排

• 发表时间: 2022
• 作者: Kazunari Kondo*;Nozomi Fukuda;Keisuke Soga;Yoshiba Satoko;Jumpei Narushima;Norihito Shibata;Chie Taguchi;Kozue Sakata;Reiko Kato
• 通讯作者: Reiko Kato