Development of cell-cycle-regulated CRISPR/Cas system

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本研究課題では、医療分野や農業分野での安全な利用を目指して，細胞周期に応じて適切なゲノム編集活性を示す「細胞周期制御型CRISPR/Casシステム」を構築するために必要な基盤研究を行うものである.修復エラーが多い非相同末端結合修復を阻害し、細胞周期のS～G2/M期への同調が編集効率と精度向上に有効であると考えられているが ，細胞周期の変化が生物自身のゲノムや細胞機能に与える影響はこれまで全く検討されていない。ヒト細胞（RPE-1）を用いて、CRISPR/CasによりDNA2本鎖誘導の過程で起きる現象について、各細胞周期で誘導するすべての変異と遺伝子発現変化を解析することで，各細胞周期で最適な条件でゲノム編集を実行できるシステムの確立を行う.すなわち、細胞自身のDNA修復機能に手を加えず，最適な細胞周期条件でゲノム編集が実行されるシステム構築を行うものである.１年目は、DNA２本鎖切断後の欠失が生じた細胞を蛍光検出できる、レポーター細胞構築のためのベクターコンストラクトを、蛍光タンパク発現をTet-on制御下で出来るようにした上で、ヒトゲノムの異なる標的部位に挿入できるように設計した。ヒト２倍体ゲノムのそれぞれのアレルをEmerald, または、Scarletで検出するためのドナーベクター作製を行った。2年目は、RPE-1細胞へ設計したドナーベクターを遺伝子導入してクローン化により樹立を行った。TK1 locusおよびAAVSへの導入を行ったところ、TK1 locusにemeraldを持つコンストラクト1コピー導入された細胞を樹立することが出来た。樹立した細胞について、導入配列を確認後、tet-onの作動性、細胞機能の野生型との違いのないことを確認して、現在、CRISPR/Cas9でDNA2本鎖した細胞をFACS解析出来るようにアッセイ系を構築している。