制御領域の変異同定と非コードRNA転写・スーパーエンハンサー活性化機構の解明

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【ThymoD転写とゲノムの３次元構造の検討】B細胞系及びＴ細胞系白血病細胞株を用いてThymoD-BCL11B領域のクロマチンの状態をATAC-seq、転写産物をRNA-seq、ChIPseqによるRNAポリメラーゼIIの結合状態及びヒストン修飾、3次元構造を捉えるHi-C法を実施し、正常Ｔ細胞及びすべての白血病細胞株において、ThymoD-BCL11B領域のドメイン構造の構成が異なることを確認した。さらにアクチノマイシンD、BRD4阻害剤、CDK7阻害剤を添加しゲノムの3次元構造に変動を認めるか、時間軸での解析を実施した。【ThymoD転写とメチル化制御機構の解明】スーパーエンハンサー上で生じる非コードRNA ThymoD転写がDNAメチル化に影響するか検討を行った。前述の阻害剤をそれぞれを添加し、ChIP-seqによる時間軸でTET2の結合状態、ヒストン修飾、Hi-C法、ゲノムのメチル化状態についてtarget capture法を用いて実施した。シークエンス結果を得たのちに変動を確認する予定である。【ThymoD転写領域にリクルートされる候補分子の同定】白血病細胞株にdCas9-APEX2システムを用いた標的ゲノム周辺の蛋白質修飾法を用いたプロテオミクス解析の準備を行った。一部の細胞株にdCas9-APEX2の導入に成功し、標的領域に対するsgRNA発現プラスミドのスクリーニングを実施している。【ThymoD転写産物の同定】B細胞系、Ｔ細胞系白血病細胞株、正常T細胞、患者T細胞性白血病細胞を用いたThymoD転写産物の同定も試みている。ロングリードシークエンサーによるIso-seqを完了し、対象コントロールのタンパク質をコードする遺伝子の転写産物と比較し、ThymoDのアイソフォームに違いがあることを確認できている。