Development of nuclear DNA markers and long-read sequencing methods for environmental DNA

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環境DNA研究において、検出対象を種から種内変異へと拡張する動きが活発となっている。しかし、現状のアプローチ法にはいくつかの制約がある。まず、環境DNA分析で用いられる主要なDNAマーカーはミトコンドリアDNAマーカーである。しかしミトコンドリアDNAは母性遺伝をするため、個体群の遺伝構造や遺伝的多様性を評価する上で情報量が少ない。また、環境DNAメタバーコーディングは大量の塩基配列を一挙に解読できる点において種内変異解析に有用な手法であるが、主流となっている超並列シーケンサーでは数百塩基対という短いDNA配列の解析しかできず、遺伝変異に乏しい種や集団の種内多型の検出が難しい。このような制約を克服するため、核rRNA遺伝子領域における多型マーカーの開発による雌雄の情報を反映する遺伝構造解析法の確立と、環境DNA分析への長鎖配列解析法の適用を目指し、研究を進めた。2022年度までに、琵琶湖に生息するコイ科魚類を中心として、核DNAのrRNA遺伝子の18S rRNAから28S rRNAにまたがる領域のリファレンス配列を取得した。これらの配列を元に、日本在来系統と国外より持ち込まれた外来系統の交雑が進むコイ(Cyprinus carpio)個体群をモデルとし、両者を区別する核DNAマーカーを開発した。次に、本マーカーを用い、コイの地域個体群の遺伝構造を推定するための、超並列シーケンサーによる環境DNAメタバーコーディング法の開発を行った。さらに、琵琶湖のコイの地域個体群における遺伝構造を評価するため、湖一円のコイ繁殖生息地において環境DNA試料の採取を進めた。長鎖配列解析においては、2022年度までの検証により、読み取り精度の低さから改善が必要であったナノポアシーケンサーについて、新規試薬を使用することによる精度の改善が認められた。