Development of a general method for plastid transformation using genome editing

CRISPRシステムによりプラスチドゲノムDNAに二重鎖切断を導入することで相同組換え効率の向上を図り、これを利用した形質転換手法の確立を目指した。植物材料は、葉緑体形質転換のモデル植物であるタバコNicotiana tabacumを用いた。本年度はゲノム編集コンポーネント（Cas9およびgRNA）を葉緑体内において恒常発現するベクターコンストラクトを作成した。ベクターは、ゲノム編集コンポーネントに加え、ホモロジーアームと抗生物質選抜マーカーを含む。同様に不活化したゲノム編集コンポーネント（dCas9およびgRNA）を発現するコントロールベクターも作成した。各ベクターをパーティクルガン法によってタバコ葉片へと導入し、形質転換体の作出を行った。逆転写PCRにより形質転換体においてゲノム編集コンポーネントが発現していることを確認した。不活化コントロールに比べて、ゲノム編集コンポーネントを発現するベクターにおいてより多くの植物体が再生できたことから、二重鎖切断の導入により、葉緑体形質転換の効率が向上することが示唆された。また、標的部位において、相同組換えを伴わないDNA修復（遺伝子ノックアウト）が生じたかを検出する目的で、次世代シークエンサーによる解析を行った。標的部位において、通常の形質転換により生じるノックインを除くと、自然変異しか検出できなかった。本システムにおいて、遺伝子ノックアウトはほとんど生じないことが示唆された。

CRISPRシステムによりプラスチドゲノムDNAに二重鎖切断を導入することで相同組換え効率の向上を図り、これを利用した形質転換手法の確立を目指した。植物材料は、葉緑体形質転換のモデル植物であるタバコNicotiana tabacumを用いた。本年度はゲノム編集コンポーネント（Cas9およびgRNA）を葉緑体内において恒常発現するベクターコンストラクトを作成した。ベクターは、ゲノム編集コンポーネントに加え、ホモロジーアームと抗生物質選抜マーカーを含む。同様に不活化したゲノム編集コンポーネント（dCas9およびgRNA）を発現するコントロールベクターも作成した。各ベクターをパーティクルガン法によってタバコ葉片へと導入し、形質転換体の作出を行った。逆転写PCRにより形質転換体においてゲノム編集コンポーネントが発現していることを確認した。不活化コントロールに比べて、ゲノム編集コンポーネントを発現するベクターにおいてより多くの植物体が再生できたことから、二重鎖切断の導入により、葉緑体形質転換の効率が向上することが示唆された。また、標的部位において、相同組換えを伴わないDNA修復（遺伝子ノックアウト）が生じたかを検出する目的で、次世代シークエンサーによる解析を行った。標的部位において、通常の形質転換により生じるノックインを除くと、自然変異しか検出できなかった。本システムにおいて、遺伝子ノックアウトはほとんど生じないことが示唆された。