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Development of a general method for plastid transformation using genome editing

使用基因组编辑开发质体转化的通用方法

基本信息

批准号：
19K15836
负责人：
渡邊健太
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Institute of Physical and Chemical Research
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
财政年份：
2019
资助国家：
日本
起止时间：
2019-04-01 至 2021-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-19K15836/
关键词：
葉緑体形質転換ゲノム編集葉緑体 CPP 形質転換

项目摘要

CRISPRシステムによりプラスチドゲノムDNAに二重鎖切断を導入することで相同組換え効率の向上を図り、これを利用した形質転換手法の確立を目指した。植物材料は、葉緑体形質転換のモデル植物であるタバコNicotiana tabacumを用いた。本年度はゲノム編集コンポーネント（Cas9およびgRNA）を葉緑体内において恒常発現するベクターコンストラクトを作成した。ベクターは、ゲノム編集コンポーネントに加え、ホモロジーアームと抗生物質選抜マーカーを含む。同様に不活化したゲノム編集コンポーネント（dCas9およびgRNA）を発現するコントロールベクターも作成した。各ベクターをパーティクルガン法によってタバコ葉片へと導入し、形質転換体の作出を行った。逆転写PCRにより形質転換体においてゲノム編集コンポーネントが発現していることを確認した。不活化コントロールに比べて、ゲノム編集コンポーネントを発現するベクターにおいてより多くの植物体が再生できたことから、二重鎖切断の導入により、葉緑体形質転換の効率が向上することが示唆された。また、標的部位において、相同組換えを伴わないDNA修復（遺伝子ノックアウト）が生じたかを検出する目的で、次世代シークエンサーによる解析を行った。標的部位において、通常の形質転換により生じるノックインを除くと、自然変異しか検出できなかった。本システムにおいて、遺伝子ノックアウトはほとんど生じないことが示唆された。

CRISPR is a new type of DNA. Plant material, chloroplast shape change, plant material, chloroplast shape change, chloroplast shape change This year, we will compile a database of gene expression (Cas9 and gRNA), which is constantly occurring in chloroplasts.ベクターは、ゲノム编集コンポーネントに加え、ホモロジーアームと抗生物质选抜マーカーを含む。In the same way, the activation of the database is necessary to create a database for the generation of data (dCas9 and gRNA). Each of the following methods is used to introduce the blade and make the shape change. Reverse PCR is the first step in the development of a novel DNA sequence. Without activation of the chloroplast, the efficiency of chloroplast transformation can be increased by increasing the efficiency of chloroplast regeneration, introducing double locks, and increasing the efficiency of chloroplast regeneration. DNA repair (DNA repair), target site analysis, sub-generation analysis The target part is usually changed in shape and quality, and the target part is naturally changed. This is the first time I've ever seen a person who's been in a relationship with someone else.