ミトコンドリアDNA量制御の時間生物学モデルの開発

线粒体 DNA 含量控制的时间生物学模型的开发

• 批准号: 19K16033
• 负责人: 山口 碧
• 金额: $ 2.75万
• 依托单位: Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• 财政年份: 2019
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2019-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-19K16033/
• 关键词: ミトコンドリアDNA; ミトコンドリアDNA量; マウス; CRISPR/Cas9; ミトコンドリア DNA; ミトコンドリア DNA量; コピー数変化; 時計遺伝子; 時間生物学

これまでに研究代表者は、経時的に採取したマウスの特定組織においてミトコンドリアDNA (mtDNA) の量およびmtDNAの複製に関わる遺伝子の発現が時間依存的に変化していること、また、組織によってその日内変動に差があることを分子生物学的解析により明らかにし、mtDNA量が分子時計による支配を受けていることが示唆された。そこでmtDNAの量の概日的制御機構に着目し、CRISPR/Cas9システムを用いた時計遺伝子欠損マウスの作製を試みた。昨年度に引き続き、十分な切断効率を有するguide RNA (gRNA) を選定し、Cas9ヌクレアーゼとgRNA複合体 (RNP) をエレクトロポレーション法にてマウス前核期受精卵に導入した後、二細胞期胚を偽妊娠雌マウスの卵管内に移植した。得られた産仔について、PCRとシークエンス解析により標的遺伝子の編集成否の確認を行った結果、変異個体が全く得られなかった。次に、標的を再設計し、人工合成した複数種類のgRNAおよびCas9タンパクをRNPとしてマウス前核期受精卵にエレクトロポレーションにより導入した。体外培養によって胚盤胞期胚まで発生させた後、PCRおよびシークエンス解析にて十分な切断効率を有するgRNAを選定した。続いて、同様の手順によりRNP導入後の2細胞期胚を偽妊娠雌マウスの卵管内に移植したが、全く産仔を得ることができなかった。現在、標的配列の再設計を行い、引き続きKOマウスおよびコンディショナルKOマウスの作製を計画している。

This study represents the time-dependent evolution of DNA (mtDNA) content and mtDNA replication in specific tissues, and the analysis of molecular biology to determine the time-dependent evolution of mtDNA content and mtDNA replication. CRISPR/Cas9 is the most important gene in the genome. In the past year, there were guide RNA (gRNA) selection, Cas9-linked RNA complex (RNP) selection, and 2-cell embryo transfer in vitro. The results of PCR analysis and identification of the target gene are as follows: Second, the target is redesigned, artificially synthesized, and introduced into the pre-nuclear fertilized egg. In vitro culture of blastocysts, PCR analysis and identification of gRNA 2-cell embryo after RNP introduction, pseudo-pregnant female embryo and egg tube transfer, full birth Now, the design of the target layout is in progress, and the design of the target layout is in progress.