ミトコンドリアDNA量制御の時間生物学モデルの開発

线粒体 DNA 含量控制的时间生物学模型的开发

基本信息

批准号：
19K16033
负责人：
山口碧
金额：
$ 2.75万
依托单位：
Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
财政年份：
2019
资助国家：
日本
起止时间：
2019-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

これまでに研究代表者は、経時的に採取したマウスの特定組織においてミトコンドリアDNA (mtDNA) の量およびmtDNAの複製に関わる遺伝子の発現が時間依存的に変化していること、また、組織によってその日内変動に差があることを分子生物学的解析により明らかにし、mtDNA量が分子時計による支配を受けていることが示唆された。そこでmtDNAの量の概日的制御機構に着目し、CRISPR/Cas9システムを用いた時計遺伝子欠損マウスの作製を試みた。昨年度に引き続き、十分な切断効率を有するguide RNA (gRNA) を選定し、Cas9ヌクレアーゼとgRNA複合体 (RNP) をエレクトロポレーション法にてマウス前核期受精卵に導入した後、二細胞期胚を偽妊娠雌マウスの卵管内に移植した。得られた産仔について、PCRとシークエンス解析により標的遺伝子の編集成否の確認を行った結果、変異個体が全く得られなかった。次に、標的を再設計し、人工合成した複数種類のgRNAおよびCas9タンパクをRNPとしてマウス前核期受精卵にエレクトロポレーションにより導入した。体外培養によって胚盤胞期胚まで発生させた後、PCRおよびシークエンス解析にて十分な切断効率を有するgRNAを選定した。続いて、同様の手順によりRNP導入後の2細胞期胚を偽妊娠雌マウスの卵管内に移植したが、全く産仔を得ることができなかった。現在、標的配列の再設計を行い、引き続きKOマウスおよびコンディショナルKOマウスの作製を計画している。

迄今为止，研究人员透露，线粒体DNA（mtDNA）的量以及参与MTDNA复制的基因的表达，随着时间的时间收集的小鼠的特定组织中的时间变化，该内盘变化取决于组织的变化，这取决于MTDNA的量，这表明MTDNA的量占了分子时钟。因此，我们专注于控制mtDNA量的昼夜节律机制，并试图使用CRISPR/CAS9系统创建时钟缺陷的小鼠。从去年开始，选择了具有足够裂解效率的引导RNA（GRNA），使用电穿孔将CAS9核酸酶和GRNA复合物（RNP）引入小鼠前核受精卵中，并将两个细胞阶段的胚胎植入伪孕妇雌性小鼠的肠管管中。通过PCR和测序分析确认获得的混蛋，以确认是否编辑了靶基因，并且未获得突变个体。接下来，重新设计了该靶标，并通过电穿孔将多个人为合成的GRNA和Cas9蛋白作为RNP引入小鼠前核受精卵中。通过体外培养产生胚泡阶段的胚胎后，通过PCR和测序分析选择具有足够裂解效率的GRNA。随后，通过相同的程序将RNP引入后的两细胞阶段胚胎植入了假孕的雌性小鼠的输卵管中，但未获得任何出生。目前，我们正在重新设计目标序列，并计划继续产生KO和有条件的KO小鼠。