感染性難治性足潰瘍に対するペプチドを併用した創内持続陰圧洗浄療法の開発

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皮下に黄色ブドウ球菌 (5 x 108 cfu程度用いる)を接種する。翌日、イソフルラン2-3%麻酔下にラットの背側皮膚 にハサミを用いて、細菌を接種させた部位に 10x10mmの皮膚潰瘍を作製する。細菌接種後1， 3，5，7日目に創傷治癒過程の個体を順次麻酔下に固定し，組織学的解析試料を作製する。創 傷の評価は以下の 項目を測定して行う。1) 皮膚欠損創の大きさ;長径とそれと直行する短径をスケールで計測する。2) 肉芽組織内の細胞種(線維芽細胞、血管内皮細胞およびマクロファージ等の炎症細 胞) の構成比や形態および定量解析;免疫化学染色法を用いるが、HSP47で線維芽細胞を、Iba-1 でマクロファージを、血管内皮細胞をCD31で染めて1視野内の細 胞数を数える。3) 肉芽組織のコラーゲン定量;肉芽形成期の早期にはコラーゲンIII型が増加し、その後創 傷治癒過程が進むとコラーゲンIII型はI型に置換され る。免疫染色で経時的変化をコラーゲン I,III型各々染色して観察する。4) 肉芽組織内の細菌数の定量;潰瘍面を綿棒で拭い、細菌数測定装置(細菌カウンタ)で 細 菌濃度(cfu/ml)を測定する。感染創の出来が悪い時は菌体濃度を上げる。「創内持続陰圧洗浄療法」に抗菌ペプチドを併用し、治療開始後1，3，5，7日目で の組織像を、前述の1)から4)で比較して評価する。1)から4)に関しては概ね再現性を得られた。 使用する抗菌ペプチドとしては、αーディフェンシン、βーディフェンシン、LL-37、ヒスタチンなどを用いる。また、使用する抗菌ペプチドの濃度は、 10~100nM程度から始め、効果を調べながら濃度を増減していく。