一分子蛍光イメージングを用いたヒトDNA複製開始因子の動態解明

使用单分子荧光成像阐明人类 DNA 复制起始因子的动态

• 批准号: 19K23735
• 负责人: 伊藤 優志
• 金额: $ 1.83万
• 依托单位: National Institute of Genetics
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Research Activity Start-up
• 财政年份: 2019
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2019-08-30 至 2021-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-19K23735/
• 关键词: ヌクレオソーム; クロマチン; 一分子蛍光イメージング; 蛍光顕微鏡; 転写; DNA複製; オーキシン; 液液相分離; RNA転写; ヒト細胞; 一分子蛍光顕微鏡; イメージング

当該年度は、一分子蛍光顕微鏡を用いてヌクレオソームの動きを追跡した。具体的には、Haloタグを修飾したヒストンタンパク質H2Bを持つ細胞を作製し、その細胞に蛍光色素を加えることで、ヌクレオソーム一分子を蛍光で可視化した。RNAの転写がヌクレオソームの運動に与える影響を検証するために、転写に関わるメディエータータンパク質複合体を分解した。初めに、ヒトHCT116細胞を使用し、オーキシンという薬剤に応答してメディエータータンパク質を分解するシステムを持つ細胞を作製した。その細胞を使用し、メディエータータンパク質の一つであるMED14を分解したところ、ヌクレオソームの動きがわずかに増加した。しかし、その増加幅は、転写阻害剤を使用した実験のものよりも小さかった。この結果から、クロマチンの架橋に対するメディエータータンパク質複合体の寄与は小さいということが示唆された。一方、HCT116細胞は、核のサイズに対して占める核小体の割合が大きいために、ヌクレオソームの動きの変化が小さかった可能性も考えられた。そのため、現在、別の細胞であるヒトDLD-1細胞を使用し、メディエータータンパク質を分解するシステムを持つ細胞を作製している。また、DLD-1細胞においても、転写阻害剤で細胞を処理したり、RNAポリメラーゼを分解したりすることで、転写が阻害されてヌクレオソームの動きが顕著に増加することを確認した。

When the annual は, a molecular 蛍 light 顕 micromirror を with い て ヌ ク レ オ ソ ー ム の dynamic き を tracing し た. Specific に は, Halo タ グ を modified し た ヒ ス ト ン タ ン パ ク qualitative H2B を hold し the つ cells を cropping, そ の cells に 蛍 photopigment を plus え る こ と で, ヌ ク レ オ ソ ー ム a molecular を 蛍 light で visualization し た. RNA の planning write が ヌ ク レ オ ソ ー ム に の movement and え る influence を 検 card す る た め に, planning to write に masato わ る メ デ ィ エ ー タ ー タ ン パ ク qualitative complex を decomposition し た. Early め に, ヒ ト を HCT116 cells using し, オ ー キ シ ン と い う 薬 tonic に 応 answer し て メ デ ィ エ ー タ ー タ ン パ ク qualitative を decomposition す る シ ス テ ム を hold つ cells を cropping し た. を そ の cells using し, メ デ ィ エ ー タ ー タ ン パ ク qualitative の a つ で あ る MED14 を decomposition し た と こ ろ, ヌ ク レ オ ソ ー ム の dynamic き が わ ず か に raised plus し た. The increase range of <s:1> そ <e:1>, 転 write the inhibition agent を, use of <s:1> た experiment <s:1> よ よ よ <s:1> small さ った った. こ の results か ら, ク ロ マ チ ン の bridging に す seaborne る メ デ ィ エ ー タ ー タ ン パ ク qualitative complex の send with は small さ い と い う こ と が in stopping さ れ た. Side, は HCT116 cells, nuclear の サ イ ズ に し seaborne て of め る nucleosome の cut close が big き い た め に, ヌ ク レ オ ソ ー ム の dynamic き の small variations change が さ か っ た possibility も exam え ら れ た. そ の た め, now, don't の cells で あ る ヒ ト DLD clutches - 1 cell を use し, メ デ ィ エ ー タ ー タ ン パ ク qualitative を decomposition す る シ ス テ ム を hold つ cells を cropping し て い る. ま た, DLD clutches - 1 cell に お い て も, planning to write resistance against tonic で cells を 処 Richard し た り, RNA ポ リ メ ラ ー ゼ を decomposition し た り す る こ と で, planning to write が resistance against さ れ て ヌ ク レ オ ソ ー ム の dynamic き が 顕 with に raised す る こ と を confirm し た.

项目成果

RNAポリメラーゼIIにより制御されるクロマチンダイナミクス

RNA 聚合酶 II 控制的染色质动力学

• 发表时间: 2019
• 作者: 伊藤優志;Babokhov Michael;日比野佳代;前島一博
• 通讯作者: 前島一博