一分子蛍光イメージングを用いたヒトDNA複製開始因子の動態解明

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当該年度は、DNA二重鎖の塩基対間に挿入する分子である、インターカレーターで細胞を処理したときの、クロマチンの動きの変化を調べた。初めに、Haloタグで標識したヒストンH2Bを発現する細胞を作製した。作製した細胞を蛍光色素TMRが結合したHaloTagリガンドで処理することで、ヌクレオソームを蛍光で標識した。斜光照明顕微鏡を用いてレーザー光を細胞に照射し、蛍光標識ヌクレオソームから放出された蛍光をCMOSカメラで検出した。トラッキングアルゴリズムを用いてヌクレオソームの運動を自動追跡し、運動の速さの指標となる平均二乗変位を定量的に求めた。細胞をインターカレーターの一種であるドキソルビシンで処理すると、クロマチンの動きが抑制された。また、クロマチンの動きはドキソルビシンの濃度依存的に抑制された。異なるインターカレーターである、ダウノマイシンとアクチノマイシンDで細胞を処理した場合も同様に、クロマチンの運動が減少した。したがって、クロマチンの運動の抑制は一般的なインターカレーターに共通の性質であると考えられる。続いて、インターカレーターによるクロマチン運動の抑制が可逆的な反応かどうか検証した。ドキソルビシンで処理した細胞を液体培地で洗浄することで、ドキソルビシンを除いた。ドキソルビシン除去後、時間依存的にクロマチンの運動が増加し、7時間で処理前の状態に戻った。したがって、ドキソルビシンによるクロマチンの運動の抑制は、可逆的な反応であると考えられる。また、生細胞内のTopBP1タンパク質の運動を追跡し、各軌跡の拡散係数を定量的に求めた。その結果、拡散係数の値の分布が2成分から成ることが分かった。速い拡散の成分は細胞核内を拡散するTopBP1分子に対応し、遅い拡散の成分はクロマチンに結合したTopBP1に対応すると考えられる。