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一分子蛍光イメージングを用いたヒトDNA複製開始因子の動態解明

使用单分子荧光成像阐明人类 DNA 复制起始因子的动态

基本信息

批准号：
20J00572
负责人：
伊藤優志
金额：
$ 2.58万
依托单位：
National Institute of Genetics
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2020
资助国家：
日本
起止时间：
2020-04-24 至 2023-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

当該年度は、DNA二重鎖の塩基対間に挿入する分子である、インターカレーターで細胞を処理したときの、クロマチンの動きの変化を調べた。初めに、Haloタグで標識したヒストンH2Bを発現する細胞を作製した。作製した細胞を蛍光色素TMRが結合したHaloTagリガンドで処理することで、ヌクレオソームを蛍光で標識した。斜光照明顕微鏡を用いてレーザー光を細胞に照射し、蛍光標識ヌクレオソームから放出された蛍光をCMOSカメラで検出した。トラッキングアルゴリズムを用いてヌクレオソームの運動を自動追跡し、運動の速さの指標となる平均二乗変位を定量的に求めた。細胞をインターカレーターの一種であるドキソルビシンで処理すると、クロマチンの動きが抑制された。また、クロマチンの動きはドキソルビシンの濃度依存的に抑制された。異なるインターカレーターである、ダウノマイシンとアクチノマイシンDで細胞を処理した場合も同様に、クロマチンの運動が減少した。したがって、クロマチンの運動の抑制は一般的なインターカレーターに共通の性質であると考えられる。続いて、インターカレーターによるクロマチン運動の抑制が可逆的な反応かどうか検証した。ドキソルビシンで処理した細胞を液体培地で洗浄することで、ドキソルビシンを除いた。ドキソルビシン除去後、時間依存的にクロマチンの運動が増加し、7時間で処理前の状態に戻った。したがって、ドキソルビシンによるクロマチンの運動の抑制は、可逆的な反応であると考えられる。また、生細胞内のTopBP1タンパク質の運動を追跡し、各軌跡の拡散係数を定量的に求めた。その結果、拡散係数の値の分布が2成分から成ることが分かった。速い拡散の成分は細胞核内を拡散するTopBP1分子に対応し、遅い拡散の成分はクロマチンに結合したTopBP1に対応すると考えられる。

When the DNA double lock is inserted into the cell, the cell is processed, and the cell is modulated. H2B is the first cell to be activated. For example, if a cell is to be treated with HaloTag, it is to be treated with HaloTag. Oblique illumination micromirrors are used to illuminate cells and emit light from CMOS cameras. The movement of the vehicle is automatically tracked by the vehicle speed index and the average two-dimensional position is calculated by the vehicle speed index. The cell is a kind of "clean room,""clean room,""clean room," and "clean room." The concentration dependent inhibition of the activity of the protein was investigated. Different types of cells are processed in the same way. The common nature of the movement of the common people In the middle of the game, the movement of the game is reversible. The solution to the problem of cell culture is to eliminate the problem of cell culture. After the removal of the solution, the time-dependent solution motion increases, and the 7-time solution state increases. The movement of the body is reversible. The motion of TopBP1 in the living cell is traced and the dispersion coefficient of each trajectory is quantitatively calculated. The result is that the distribution of dispersion coefficient is 2 components. The components of the drug are dispersed in the nucleus of the cell, and the components of the drug are combined with the molecules of TopBP1.