固液界面機能と脂質二重膜を用いた人工生体膜反応場の構築

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脂質二重膜と膜タンパク質が構成する分子集合体は、細胞膜を通しての細胞内外の情報伝達・物資輸送を担っている。本研究では、膜内分子集合体を人工脂質二重膜系と無細胞タンパク質合成系を用いて組み立て、その働く機構を明らかにすることを目的とする。hERGチャネルを対象として、支持脂質二重膜(SLB)への再構成と分子像観察、無細胞合成系での4量体形成、活性構造と薬剤応答の観察の3つの課題に取り組む。2022年度は、前年度までに見出した膜融合サイトとして働く多価不飽和脂質ドメインの膜融合速度依存性、天然物由来の脂質によるSLB形成、AFM観察の条件再検討および無細胞合成の条件検討に取り組んだ。フォスファチジルコリン(PC)、フォスファチジルエタノールアミン(PE)およびコレステロール(Chol)からなる三成分SLBにおいて多価不飽和PEが誘起する微小脂質ドメインはが、膜融合サイトとして働くことを前年度までに見出した。このドメインはイオンチャネルのAFM観察や電流計測などにおいてチャネルタンパク質を再構成する際のプロテオリポソーム(PL)の融合に必須である。この膜融合効率速度について、多価不飽和PEの不飽和度依存性をSLBへのベシクル融合速度を指標として調べた。SLBとベシクルをそれぞれ緑、赤の蛍光標識脂質でラベルし、SLBにベシクルを添加した後にSLBからの赤の蛍光強度を計測した。ベシクルの多価不飽和度が高いほど融合が速く進行し、その速度を定量的に評価することができた。人工脂質二重膜系への膜タンパク質再構成におけるボトルネックを解消するための知見としても有用である。hERGチャネルの発現は従来通りコムギ胚芽抽出物を用いた無細胞合成で行うが、4量体形成の効率を向上するために用いる脂質の種類も含めて発現と精製の条件を再度検討し直した。