ヒスチジンメチル化酵素METTL9の活性制御機構と生物学的意義の解明

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研究代表者は、独自のメチル化修飾検出法として、対象とするタンパク質を酸加水分解してメチルアミノ酸をLC-MS/MS分析する方法を確立し、これにRNAiスクリーニングを組み合わせることで、ヒスチジン残基のπメチル化を触媒する酵素METTL9を世界で初めて同定した。昨年度の研究成果において、METTL9の新規の翻訳後修飾としてN結合型糖鎖が付加されている可能性が見出されたことから、今年度はその検証と分子機能への影響を検討した。METTL9のアミノ酸配列中には、N結合型糖鎖修飾のコンセンサス配列であるNxS/Tが2カ所存在することから、ここに点変異を加えた2NA変異体を作製したところ、野性型でみられるWBでのバンドのシフトアップが消失した。またアスパラギン残基とアセチルグルコサミンとの結合を切断する酵素で処理した場合でも同様の結果が見られたことから、METTL9は2カ所でN結合型糖鎖修飾を受けていることが分かった。この糖鎖修飾がもつMETTL9の分子機能への役割を調べたところ、メチル化酵素活性や細胞内局在は影響を受けなかったものの、糖鎖依存的な結合因子が存在することが明らかになった。この発見をきっかけにして、METTL9のジスルフィド結合や細胞外分泌の可能性に関して検討を行った。その結果、METTL9は小胞体内でジスルフィド結合による二量体を形成し、その後、ゴルジ体を経て、細胞外に分泌していることを示唆する結果が得られた。ただしこの実験では、発光による高感度検出が可能なHiBiTタグを用いていることから、現在、培養上清中に実際にMETTL9が分泌されることをWBを用いて検出できるか検討している。